雙切口滾環(huán)擴增檢測方法及其原理初探.pdf

1、隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,對蝦集約化養(yǎng)殖模式的到來,對蝦疾養(yǎng)殖過程中疾病的暴發(fā)對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的損失,對蝦疾病成為制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素,因此對水產(chǎn)病害的研究變得越來越重要,而水產(chǎn)病害的檢測是病害研究的重要一環(huán),本研究對滾環(huán)擴增(Rolling circle amplification, RCA)檢測方法進行了初步研究,希望建立一種水產(chǎn)病害快速診斷檢測方法。
　　本研究根據(jù)肝胰腺細小病毒(Hepatopancr

2、eatic parvovirus, HPV)特異性序列和部分無關(guān)序列設(shè)計鎖式探針及其擴增引物,通過優(yōu)化一系列反應(yīng)條件,建立了特異性的肝胰腺細小病毒滾環(huán)擴增檢測方法。初步結(jié)果顯示該體系可以特異性檢測出肝胰腺細小病毒,而檢測不出其他幾種常見水產(chǎn)病原。實驗中對探針用一步法連接成環(huán),用提取的感染肝胰腺細小病毒的對蝦肝胰腺核酸檢測靈敏度為2ng/μl。本技術(shù)的建立可以為肝胰腺細小病毒檢測提供新的技術(shù)方法。
　　為提高滾環(huán)擴增的特異性,實驗設(shè)

3、計了雙切口滾環(huán)擴增,將探針分為長探針和引物探針兩部分,引物探針序列既用來做探針又用來做引物,當(dāng)長探針兩端序列與模板結(jié)合后中間會留有一個引物探針結(jié)合的20bp左右缺口,只有當(dāng)兩部分探針都和模板結(jié)合后,兩個切口都被連接后,才會連接形成環(huán)狀模板,然后用長探針上無關(guān)序列設(shè)計的引物和探針引物進行滾環(huán)擴增。實驗通過優(yōu)化一系列反應(yīng)條件,建立了特異性的肝胰腺細小病毒雙切口滾環(huán)擴增檢測方法。初步結(jié)果顯示該體系可以特異性檢測出肝胰腺細小病毒,而檢測不出其他

4、幾種常見水產(chǎn)病原;實驗中對探針用一步法連接成環(huán),用提取的感染肝胰腺細小病毒的對蝦肝胰腺核酸進行靈敏度檢測,其檢測極限為2ng/μl,比常規(guī)PCR檢測靈敏度低100倍。本技術(shù)的建立可以為肝胰腺細小病毒檢測提供新的技術(shù)方法。
　　本研究還建立了遲緩愛德華氏菌雙切口滾環(huán)擴增檢測方法,初步結(jié)果顯示該體系可以特異性檢測出遲緩愛德華氏菌,而檢測不出其他幾種常見水產(chǎn)病原;實驗中對探針用一步法連接成環(huán),用提取的遲緩愛德華氏菌核酸做模板進行靈敏度分

5、析,結(jié)果其靈敏度為0.4ng/μl,。
　　本研究還利用雙切口滾環(huán)擴增方法建立了固相芯片技術(shù),通過將兩條引物進行氨基化修飾,稀釋混勻后一起固定在醛基玻片上,用連接好的環(huán)作為模板,當(dāng)環(huán)狀模板中的公共序列與其引物結(jié)合后進行擴增,擴增產(chǎn)物中會出現(xiàn)探針引物的結(jié)合序列,探針引物以擴增產(chǎn)物為模板進行擴增,擴增后的產(chǎn)物會在后一條鏈的延伸過程中被置換下來,繼而成為公共引物的模板引發(fā)進行一步的擴增,實驗成功根據(jù)以上方法實現(xiàn)了固相擴增。
　　本

6、研究還利用基因芯片技術(shù),結(jié)合雙切口滾環(huán)擴增,利用一條公共引物實現(xiàn)了對肝胰腺細小病毒和遲緩愛德華氏菌的多重檢測。實驗中對基因芯片技術(shù)的多重檢測進行了引物濃度,雜交反應(yīng)時間,雜交溫度條件的優(yōu)化。
　　本文用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了一種新的淡水甲殼類的螺原體檢測方法。根據(jù)螺原體基因組DNA的gyrB基因設(shè)計了四條LAMP引物,62℃擴增1小時。L