核酸分子的尼龍膜固相滾環(huán)擴增近紅外熒光檢測.pdf

1、尼龍膜是一種核酸檢測的傳統(tǒng)固相載體，其本身攜帶正電荷，可直接通過靜電吸附和簡單的UV交聯(lián)固定核酸分子，操作簡單快捷。滾環(huán)擴增(rolling circle amplification，RCA)是一種等溫DNA擴增技術(shù)，廣泛應用于核酸的檢測。近紅外熒光（near infrared fluorescence，NIRF）因其背景低而具有高靈敏度的特點。本研究利用尼龍膜、RCA及NIRF的技術(shù)優(yōu)勢，建立了一種尼龍膜上近紅外熒光固相RCA(M-N

2、IRF-sRCA)檢測核酸分子的新方法。
　　M-NIRF-sRCA檢測系統(tǒng)僅包含兩種寡核苷酸:特異性的探針（3'端為滾環(huán)引物）和滾環(huán)(rollingcircle，RC)。檢測流程分四個步驟:(1)固定:通過UV交聯(lián)將待測靶分子固定在尼龍膜上;(2)雜交:將含有特異性滾環(huán)引物和RC的雜交體系加至尼龍膜上進行雜交;(3)滾環(huán)擴增:將固相RCA體系（包括ψ29 DNA聚合酶、RC、dNTP、biotin-dUTP）加至尼龍膜上進行RC

3、A反應;(4)成像:使用近紅外熒光素標記的鏈霉親合素（streptavidin-800CW）與尼龍膜上擴增產(chǎn)物進行孵育結(jié)合后，使用Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)對尼龍膜進行掃描成像，讀取熒光信號。
　　本實驗通過對寡核苷酸分子、質(zhì)粒和細菌基因組DNA的檢測，證明了M-NIRF-sRCA的可行性。實驗結(jié)果表明:M-NIRF-sRCA可定量檢測寡核苷酸分子，靈敏度為0.17 fmol，檢測線性范圍是0.17fmol～0.35 pmo

4、l; M-NIRF-sRCA也可定量檢測HPV質(zhì)粒，最低可檢測到0.25 fmol的高危型HPV16、HPV18和HPV33分子，檢測線性范圍為0.25 fmol～4fmol,并能實現(xiàn)6種HPV亞型的分型，包括高危型的HPV16、HPV18、HPV33、HPV35和低危型的HPV6和HPV11;另外，經(jīng)過改善后，M-NIRF-sRCA又可定量檢測DH5α gDNA，檢測靈敏度達3.09 ng gDNA分子，相當于3000個細菌，可檢測D