miR-204-211對RPE分化及去分化的影響.pdf

1、 分類號： 密級： U D C ：學(xué)號： 405604611033 南 昌 大 學(xué) 碩 士 研 究 生 學(xué) 位 論 文 miR miR-204/211 204/211 對 RPE RPE 分化及去分化的影響 分化及去分化的影響 Effects of miR-204/211 on differentiation and dedifferentiation in

2、 RPE 林少蕓 培養(yǎng)單位（院、系）： 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 指導(dǎo)教師姓名、職稱： 李思光 教授 申請學(xué)位的學(xué)科門類： 理 學(xué) 學(xué)科專業(yè)名稱： 微生物學(xué) 論文答辯日期： 答辯委員會主席： 評閱人： 2014 年 月 日 摘要 摘 要 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（the retinal pigment epithelium，RPE）在功能異常、病變或死亡時會引發(fā)多種

3、嚴(yán)重的視網(wǎng)膜疾病。 對于這些疾病， 目前普遍采用的是細(xì)胞移植治療方法。但是，由于細(xì)胞來源有限，并存在免疫排斥反應(yīng)，RPE 移植治療有很大局限性。為此，需要人工體外生產(chǎn)大量的 RPE 用于視網(wǎng)膜相關(guān)疾病的治療。但是目前人們對于 RPE 分化機(jī)制還了解不夠，迫切需要對其分化機(jī)制深化研究。本實驗室之前已經(jīng)探索過 RPE 分化過程的情況，得到了較為詳細(xì)的數(shù)據(jù)，我在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究 miRNA 對 RPE 分化及去分化的機(jī)制。 本研究選擇 AR

4、PE-19 及 hfRPE 兩個不同的 RPE 系作為研究材料， 針對 RPE分化相關(guān)信號通路中的關(guān)鍵成員，分析其潛在的 miRNA 作用靶點，找到可能對其起調(diào)控作用的 miRNAs。然后通過 QPCR 檢測，免疫染色，流式細(xì)胞周期分析及雙熒光酶標(biāo)報告基因驗證等方法，確定了 miR-204/211 對 RPE 分化及去分化的關(guān)鍵調(diào)控作用。研究結(jié)果小結(jié)如下： 1.通過文獻(xiàn)挖掘及生物信息學(xué)分析， 我們獲得了一批可能調(diào)控 RPE 分化和功能維

5、持的 miRNAs。采用 QPCR 方法鑒定出在兩個細(xì)胞系中均高表達(dá)的 miRNAs。其中包括 miR-204/211/194 等。 2.為了鑒定 miR-204/211 對 RPE 的影響，我們首先在兩個細(xì)胞系中瞬時轉(zhuǎn)染miRNA mimics。QPCR 檢測發(fā)現(xiàn) RPE 特異性基因 RPE65、CRALBP、TYRP2 在ARPE-19 和 hfRPE 兩個細(xì)胞系中表達(dá)量都有顯著性提高；轉(zhuǎn)染 miR-204/211 antagomi

6、rs 后， 上述基因表達(dá)量都有顯著性下調(diào)； 但轉(zhuǎn)染 miR-204/211 antagomirs后 10 天檢測，這些基因的表達(dá)量又會逐漸回升。細(xì)胞免疫染色結(jié)果也印證了QRCR 的結(jié)果。 3.在正常的培養(yǎng)條件下，ARPE-19 和 hfRPE 兩個細(xì)胞系均具有良好的生長能力，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的 S 型生長曲線。CCK-8 檢測細(xì)胞在傳代培養(yǎng)后第三天即可進(jìn)入對數(shù)生長期， 第六天后達(dá)到平臺期。 隨后細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱， 進(jìn)入平臺期，細(xì)胞的

7、OD 值趨于穩(wěn)定，維持在 2.0-2.2 左右。進(jìn)一步通過 PI 染色法，流式鑒定miR-204/211 含量變化對 ARPE-19、hfRPE 兩個細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)上調(diào) miR-204/211 對細(xì)胞周期沒有影響，而下調(diào) miR-204/211 后，對細(xì)胞周期有顯著性影響。 以上結(jié)果表明，miR-204/211 共同作用能夠有效地影響 RPE 的分化及去分化， 并且這種影響可能跟細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)， 這就進(jìn)一步明確了 mi