干擾及過表達(dá)miR-31對(duì)脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的:
　　1.使用Alexa FluorR Red檢測(cè)RNAiMAX對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，確定最終的轉(zhuǎn)染效率最高的時(shí)間。
　　2.觀察miR-31對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化時(shí)所起作用，研究miR-31和神經(jīng)干細(xì)胞之間的相互關(guān)系。
　　方法:
　　第一部分：RNAiMAX對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響及轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定
　　首先從胎鼠體內(nèi)獲得脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞，體外分離培養(yǎng)并鑒定。當(dāng)干細(xì)胞傳至3代后，接種于鋪設(shè)多聚賴氨

2、酸處理過蓋玻片的六孔板中，分為不加 RNAiMAX組和加RNAiMAX兩組，通過0d、1d、2d和3d的連續(xù)觀察，研究RNAiMAX對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響作用。并繼續(xù)將細(xì)胞分為1d、2d和3d三組，轉(zhuǎn)染Alexa FluorR Red觀察RNAiMAX對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)達(dá)到相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)時(shí)，取出細(xì)胞并用多聚甲醛固定，之后將細(xì)胞位于熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算發(fā)出紅色熒光細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)之比確定RNAiMAX對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
　　

3、第二部分：miR-31對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用
　　將細(xì)胞分為干擾組、干擾對(duì)照組、過表達(dá)組、過表達(dá)對(duì)照組和對(duì)照組，轉(zhuǎn)染相應(yīng)試劑后觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并通過ChAT的免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察膽堿能神經(jīng)元的分化情況。提取RNA后檢測(cè)miR-31的誘導(dǎo)是否成功，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后通過熒光定量 PCR檢測(cè)下游基因在 miR-31的表達(dá)變化后的變化情況。通過以上分析miR-31在神經(jīng)干細(xì)胞干性維持方面的作用。
　　結(jié)果：
　　第一

4、部分：當(dāng) RNAiMAX加入到神經(jīng)干細(xì)胞后，細(xì)胞開始死亡。通過在時(shí)間節(jié)點(diǎn)鏡下觀察可知，在第一天時(shí)轉(zhuǎn)染效率是20％-30%，第二天時(shí)轉(zhuǎn)染效率是40%-55%，當(dāng)達(dá)到第三天時(shí)，轉(zhuǎn)染效率為60%-75%。說明Alexa FluorR Red會(huì)隨著時(shí)間的推移增加轉(zhuǎn)染的細(xì)胞數(shù)，提高細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
　　第二部分：轉(zhuǎn)染miR-31的mimic和inhibitor后，細(xì)胞的形態(tài)和分子層面都發(fā)生了變化。形態(tài)學(xué)方面可以看出，轉(zhuǎn)染miR-31的抑制劑

5、后，細(xì)胞的形態(tài)更接近于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，細(xì)胞呈長梭形，在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中可以看出ChAT的表達(dá)升高，細(xì)胞熒光呈強(qiáng)陽性；而在轉(zhuǎn)染miR-31過表達(dá)試劑后，細(xì)胞貼壁后形態(tài)變化不明顯，突起伸出不多，ChAT的表達(dá)明顯降低，熒光強(qiáng)度明顯弱于抑制組。microRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物熒光定量PCR結(jié)果顯示干擾組的表達(dá)為0.867，干擾對(duì)照組的表達(dá)為2.406，過表達(dá)組為1.022×106，過表達(dá)對(duì)照組為1.506×105，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。而下游基因也有明

6、顯變化。在干擾組中表達(dá)明顯升高的有hb9和stmn1，表達(dá)降低的有Nestin、lats2、Rhobtb和SATB2。過表達(dá)組明顯升高的有Nestin、hb9、lats2和SATB2，表達(dá)降低的基因有Rhobtb。
　　結(jié)論：
　　1.RNAiMAX對(duì)神經(jīng)干性毒性較大，會(huì)造成大量的細(xì)胞死亡，在實(shí)驗(yàn)時(shí)需加大細(xì)胞的用量。通過轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定，RNAiMAX在第三天的轉(zhuǎn)染效率最高。
　　2.miR-31高表達(dá)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有很好