肝細胞去分化及其機制.pdf

1、目的:
　　傳統(tǒng)觀點認為組織發(fā)育和細胞分化是一個單向性的過程，即由干細胞/前體細胞向體細胞分化。因此，在組織正常更新或損傷情況下，干細胞/前體細胞在組織再生過程中發(fā)揮重要作用。然而，到目前為止，干細胞/前體細胞的這種重要作用只在僅有的幾個器官中得到證實，其他大多數(shù)器官中則缺乏相應(yīng)的研究證據(jù)。肝臟就是其中之一。
　　肝臟中的干細胞/前體細胞稱為肝前體細胞（Hepatic Progenitor Cells，HPCs），其可向肝細

2、胞和膽管上皮細胞雙向分化。由于HPCs可表達多種細胞標志物而缺乏特異性標志物，其來源到目前為止尚不十分清楚。傳統(tǒng)觀點認為HPCs來自膽管末端的Hering管，也有研究提示骨髓干細胞、肝星狀細胞等也是HPCs來源之一。此外，也有研究顯示肝細胞可作為HPcs的另一來源。肝臟由于其特殊的位置和功能，使其成為生物體中非常特殊的器官之一。作為其主要實質(zhì)構(gòu)成及功能發(fā)生單位，肝細胞也因此擁有與其他體細胞不同的生理特性，如可無限增殖及向膽管上皮細胞轉(zhuǎn)化

3、等。最新的體內(nèi)外研究顯示肝細胞也可去分化為HPCs。然而，這些研究均缺乏嚴謹?shù)淖V系追蹤證據(jù)加以證實，也未對肝細胞去分化的機制做深一步的研究。
　　肝細胞核因子4α(Hepatocyte Nuclear Factor4α，HNF4α)是肝臟富集的一類轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用。研究顯示HNF4α還可促進肝癌細胞向成熟肝細胞分化，但其在成熟肝細胞去分化中的作用未見報道。
　　基于以上研究背景，本研究利用多種轉(zhuǎn)基

4、因小鼠及動物模型明確不同肝損傷情況下肝細胞在肝臟再生中的作用及肝細胞是否可作為肝前體細胞來源之一，并初步探討其機制。
　　方法:
　　一、肝細胞特異性表達綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建
　　甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)為肝細胞特異性表達蛋白。本研究采用mTomato-mGFP雙重?zé)晒鈽擞浶∈?，攜帶TBG啟動子及內(nèi)含子的血清Ⅷ型腺相關(guān)病毒(AAV8-TBG)可驅(qū)動下游基因在成熟肝細胞中特異表達。小鼠尾靜脈注射攜帶C

5、re重組酶基因的AAV8-TBG(AAV8-TBG-Cre)后使肝細胞特異性標記GFP而呈現(xiàn)綠色熒光，其他非肝細胞呈現(xiàn)紅色熒光。
　　二、明確急性肝損傷時肝臟再生情況
　　mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標記肝細胞后，給予腹腔注射四氯化碳每周兩次注射兩周，或行肝大部切除術(shù)，構(gòu)建急性肝損傷模型。觀察肝臟組織中紅色和綠色熒光標記區(qū)域的細胞變化情況。免疫熒光檢測HNF4α與紅色或綠色熒光表達。

6、　　三、明確慢性肝損傷時肝細胞是否可以去分化為HPCs
　　上述老鼠繼續(xù)延長DDC飲食造模時間，免疫熒光檢測PCK、EpCAM、Sox9等HPCs標志物表達并追蹤其熒光標記。在CDE飲食模型中重復(fù)觀察上述現(xiàn)象。分離小鼠原代肝細胞，收集RNA和蛋白，RT-PCR和Western blot檢測成熟肝細胞及HPCs相關(guān)基因表達。
　　四、初步明確HNF4α表達在肝細胞去分化中的作用
　　分離DDC飲食不同時間點小鼠原代肝細胞

7、，收集RNA和蛋白，RT-PCR和Westernblot檢測各時間點HNF4α表達量變化。將mTomato-mGFP小鼠與HNF4aflox/flox小鼠雜交后，尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre，構(gòu)建肝細胞特異性敲除HNF4α轉(zhuǎn)基因小鼠，免疫熒光檢測肝臟組織中Sox9的表達。分離小鼠原代肝細胞，收集RNA和蛋白，RT-PCR和Western blot檢測成熟肝細胞及HPCs相關(guān)基因表達。
　　結(jié)果:
　　一、成功構(gòu)建肝細胞

8、特異性表達GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠
　　mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre后可見肝臟組織內(nèi)除匯管區(qū)及間質(zhì)部位細胞表達綠色熒光外，幾乎所有肝細胞形態(tài)的細胞表達綠色熒光。免疫熒光對多種細胞特異性標志物如HNF4α、PCK、Sox9、GFAP、α-SMA、F4/80、CD34檢測，發(fā)現(xiàn)所有表達綠色熒光的細胞均為肝細胞，而其他細胞包括膽管上皮細胞、肝星狀細胞、Kupffer細胞、血管內(nèi)皮細胞等則表達紅色熒光。表明該模

9、式動物可明確的區(qū)分出肝細胞和非肝細胞，結(jié)合免疫熒光技術(shù)我們可直觀的探究肝細胞的來源和去路，是進行譜系追蹤研究肝細胞去分化的理想動物模型。
　　二、急性肝損傷后再生肝細胞來源于肝細胞自我復(fù)制
　　mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標記肝細胞，腹腔注射四氯化碳或行肝大部切除術(shù)構(gòu)建急性肝損傷模型，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)門靜脈區(qū)域紅色熒光標記的細胞數(shù)量無明顯增加，也未發(fā)現(xiàn)紅色熒光標記的肝細胞樣細胞的出現(xiàn)，HNF

10、4α檢測也發(fā)現(xiàn)所有HNF4α陽性的細胞均表達綠色熒光，未見紅色熒光標記的HNF4α陽性的細胞出現(xiàn)。提示急性肝損傷后再生過程中殘存肝細胞自我復(fù)制是新生肝細胞的唯一來源。
　　三、慢性肝損傷時肝細胞可發(fā)生去分化
　　1、繼續(xù)進行DDC飲食4-12周，每隔一周檢測各時間點肝臟再生情況。發(fā)現(xiàn)隨著DDC飲食時間的延長，散在的PCK陽性的細胞逐漸增多，至DDC飲食6周開始出現(xiàn)綠色熒光標記的PCK陽性的細胞并逐漸增多。多種HPCs標志物檢

11、測也發(fā)現(xiàn)了散在的綠色熒光標記的Sox9、EpCAM陽性的細胞。說明DDC飲食所致慢性肝損傷達一定程度時部分肝細胞發(fā)生了去分化。
　　2、普通C57小鼠進行DDC飲食造模4周，每隔一周分離各時間點小鼠原代肝細胞，收集RNSA和蛋白。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)成熟肝細胞相關(guān)基因的表達逐漸降低，HPCs相關(guān)標志物的表達明顯增加。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)隨著DDC飲食延長，Sox9的表達逐漸增加。分別在RNA和蛋白水平證實了肝細胞去分化

12、現(xiàn)象。
　　3、mTomato-mGFP小鼠尾靜脈注射AAV8-TBG-Cre標記肝細胞，給予CDE飲食造模，觀察肝臟組織再生情況。我們同樣觀察到隨著CDE飲食的延長，門靜脈區(qū)域紅色熒光標記的細胞數(shù)量逐漸增多。至CDE飲食6周開始出現(xiàn)散在的綠色熒光標記的Sox9、PCK、EpCAM陽性的細胞。提示CDE飲食所致慢性肝損傷中肝細胞去分化現(xiàn)象仍然存在。
　　四、肝細胞特異性敲除HNF4α后可發(fā)生自發(fā)去分化
　　1、普通C5

13、7小鼠進行DDC飲食造模4周，每隔一周分離各時間點小鼠原代肝細胞，收集RNA和蛋白，RT-PCR、Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著DDC飲食的延長，HPCs標志物表達量增加的同時HNF4α的表達量逐漸減少。提示肝細胞內(nèi)HNF4α可能在損傷后肝細胞去分化過程中發(fā)揮一定的作用。
　　2、構(gòu)建肝細胞特異性敲除HNF4α小鼠，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)在敲除HNF4α的肝細胞中，約50％的細胞表達Sox9。分離原代肝細胞，收集RNA和蛋白。R

14、T-PCR檢測發(fā)現(xiàn)HNF4α敲除小鼠成熟肝細胞相關(guān)基因的表達逐漸降低，HPCs相關(guān)標志物的表達明顯增加。Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)HNF4α敲除小鼠肝細胞中Sox9的表達明顯增加。提示HNF4α在維持成熟肝細胞功能中發(fā)揮重要作用，其表達下降是調(diào)控肝細胞去分化的重要機制之一。
　　結(jié)論:
　　一、急性肝臟損傷時肝細胞通過自我復(fù)制完成肝臟再生。
　　二、慢性肝臟損傷時肝細胞可去分化為HPCs。
　　三、HNF