肝素酶B細(xì)胞表位多抗原肽疫苗對HCC97H肝癌細(xì)胞生長及肺轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)移往往是其復(fù)發(fā)及肝癌患者死亡的最主要的原因,而肺轉(zhuǎn)移約占所有肝外轉(zhuǎn)移的55％?；诋?dāng)下原發(fā)性肝癌根治率相對較低且復(fù)發(fā)率較高的現(xiàn)狀,肝癌的免疫治療近些年來研究較為熱門。原發(fā)性肝癌患者由于免疫耐受不能對自身抗原產(chǎn)生應(yīng)答,而通過外源性免疫則有望打破免疫耐受,提高免疫應(yīng)答,從而達(dá)到延緩腫瘤進(jìn)展、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移甚至治愈腫瘤的目的。但是由于免疫原性差、免疫抑制現(xiàn)象的發(fā)生及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的干擾等因素,現(xiàn)有的大多數(shù)原發(fā)性肝癌免疫治療的療效尚不

2、令人滿意或不確切,單獨(dú)應(yīng)用的效果更是差強(qiáng)人意。因此,為了進(jìn)一步提高免疫治療的免疫效能和抗腫瘤的特異性,非常有必要探索一條新的原發(fā)性肝癌的免疫治療途徑。
　　作為一種新型的抗腫瘤免疫治療途徑,腫瘤表位肽疫苗近年來獲得了迅速的發(fā)展。表位肽疫苗與其它疫苗相比,具有成分簡單,誘發(fā)的免疫反應(yīng)針對性強(qiáng),擺脫了病理性表位的影響等特點(diǎn),但由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)單一,往往造成免疫原性降低,在體內(nèi)不能誘發(fā)理想的免疫反應(yīng),特別是體液免疫反應(yīng),這也是B淋

3、巴細(xì)胞表位肽腫瘤疫苗相關(guān)的研究較少的主要原因。近年來提出的多抗原肽(Muptile Antigenic Peptides, MAP)設(shè)計方案,不但能很好模擬天然表位構(gòu)象,而且無需再偶聯(lián)載體蛋白,因此,采用 MAP方案設(shè)計的分枝狀多抗原表位復(fù)合肽,既能提高肽類疫苗的免疫效能又能去除載體蛋白本身具有免疫原性的缺陷。
　　除了結(jié)構(gòu)方面的設(shè)計,在 MAP疫苗的開發(fā)、研究中,選擇合適的腫瘤相關(guān)抗原(Tumor associated anti

4、gen,TAA)作為免疫治療靶點(diǎn)也顯得十分重要。肝素酶與其他的TAA不同,普遍高表達(dá)于高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞株和轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中,在哺乳動物的淋巴器官、胎盤及血小板中少量表達(dá)。在所有的糖苷類內(nèi)切酶中,肝素酶是唯一能破壞細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix,ECM)和基底膜(Basement membrane,BM)的必需酶,在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移及促進(jìn)血管生成方面起著至關(guān)重要的作用,與實(shí)體瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

5、。
　　多位學(xué)者曾預(yù)言,肝素酶活性的抑制類制劑如反義核酸、抗體等有望開發(fā)成為一類抗腫瘤轉(zhuǎn)移的重要藥物。我們在前期關(guān)于肝素酶B淋巴細(xì)胞表位的研究工作中,采用8分枝肽偶聯(lián)的MAP方案,已成功設(shè)計、合成了肝素酶B淋巴細(xì)胞表位MAP疫苗,并證實(shí)抗人肝素酶B細(xì)胞表位MAP的多克隆抗體在體外具有抑制人肝癌細(xì)胞HCCLM6侵襲性的作用。
　　眾所周知,腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移是一個進(jìn)行性的、漫長的過程,這就決定了對腫瘤在機(jī)體內(nèi)惡性進(jìn)程的干預(yù)也不可

6、能一蹴而就。然而,目前國內(nèi)外研究所有的肝素酶抑制劑,包括反義核酸、核酶、小片段干擾RNA及抗肝素酶50kDa大亞基抗體等都存在著具有異源性、易降解、時效短、實(shí)際治療可操作性差等缺點(diǎn),因此,若能通過肝素酶B淋巴細(xì)胞表位多抗原肽疫苗在活體內(nèi)誘生出天然的、具有抑制肝素酶活性的多克隆抗體來防治原發(fā)性肝癌的生長及轉(zhuǎn)移,勢必為肝素酶在肝癌免疫治療領(lǐng)域的研究提供重要的理論基礎(chǔ)。
　　【實(shí)驗?zāi)康摹?br>　　1.用主動免疫序貫以被動免疫的方法,觀

7、察肝素酶 B淋巴細(xì)胞表位 MAP疫苗抑制原位荷瘤裸鼠肝癌生長及肺轉(zhuǎn)移的作用;2.初步探討肝素酶B細(xì)胞表位MAP疫苗防治原發(fā)性肝癌的可能作用機(jī)理及其體內(nèi)應(yīng)用的安全性。
　　【材料和方法】
　　1.實(shí)驗開始前按8分支肽方案合成肝素酶B淋巴細(xì)胞表位MAP疫苗,并主動免疫白毛黑眼(white hair black eye,WHBY)兔,獲得含特異性抗肝素酶MAP抗體的抗血清;2.用辛酸/硫酸銨鹽析法純化所得的抗血清,考馬斯亮藍(lán)測定抗

8、體濃度,通過 Western-blot試驗間接分析所含抗體的特異性及其與肝素酶蛋白可能的結(jié)合位點(diǎn);3.通過噻唑藍(lán)(MTT)試驗觀察抗肝素酶B細(xì)胞表位MAP抗體對HCC97H細(xì)胞生長曲線的影響;4.用肝素酶活性測定試劑盒檢測該疫苗所誘生的特異性抗體對HCC97H肝癌細(xì)胞肝素酶活性的抑制作用;5.通過細(xì)胞劃痕試驗和Transwell試驗觀察抗肝素酶MAP抗體對HCC97H細(xì)胞遷徙侵襲能力的影響;6.通過瘤塊擴(kuò)增法、B超及Elasto彈力測試

9、輔助、肝臟原位種植法建立BALB/c裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移模型,并在肝臟原位種植手術(shù)4周后用超聲Elasto彈力測定法對荷瘤裸鼠原位肝臟移植瘤進(jìn)行定性檢測,剔除未成瘤者;7.將60只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為6組,用不同濃度(2mg/kg、4mg/kg)的經(jīng)純化的抗血清以不同頻率通過尾靜脈注射給藥,希羅達(dá)灌胃給藥作為陽性對照,而未經(jīng)免疫的兔血清作為陰性對照;8.過繼免疫后8周,觀察并比較各組裸鼠肝癌局部生長侵襲情況及肺部微轉(zhuǎn)移灶數(shù)目;9.用ELISA法檢

10、測裸鼠血清中VEGF及bFGF的濃度;10.通過免疫組化染色、Image pro plus軟件等方法觀察并比較肝癌組織中VEGF、bFGF、CD34等的表達(dá)情況;11.通過脾臟、外周淋巴結(jié)病理切片H&E染色觀察、外周血涂片觀察等初步評估肝素酶B細(xì)胞表位MAP疫苗體內(nèi)應(yīng)用的安全性。
　　【結(jié)果】
　　1.經(jīng)主動免疫獲得了高濃度抗肝素酶B細(xì)胞表位MAP抗血清
　　用肝素酶B細(xì)胞表位MAP疫苗主動免疫WHBY兔后第50天,E

11、LISA法測得血清中抗體滴度最高值可達(dá)1:140000;經(jīng)分離抗血清、CA-AS法純化后,考馬斯亮藍(lán)測得其抗體濃度為15.2mg/ml;Western-blot結(jié)果顯示,商品化全蛋白肝素酶抗體組在65kDa附近可見一清晰條帶,而在50kDa附近可見一非常清晰的條帶;而在抗MAP抗血清組,2條非常清晰的條帶顯示于65kDa及50kDa附近,而在未經(jīng)免疫兔血清對照組在相應(yīng)位置未見明顯條帶顯示。以上結(jié)果說明,通過主動免疫的方法,獲得了含高濃度

12、、高純度且能與肝素酶50kDa大亞基及前體蛋白特異性結(jié)合的抗肝素酶B細(xì)胞表位MAP抗體的免疫血清。
　　2. MAP疫苗所誘生的特異性抗體可顯著抑制HCC97H細(xì)胞肝素酶活性及其侵襲力
　　MTT試驗結(jié)果顯示,抗MAP疫苗的多克隆抗體對HCC97H細(xì)胞的生長無明顯影響;細(xì)胞肝素酶活性抑制試驗結(jié)果顯示,與未經(jīng)免疫兔IgG對照組相比,在加入終濃度100μg/ml及50μg/ml的抗MAP多克隆抗體后,HCC97H細(xì)胞肝素酶活性分

13、別下降了51.0%(P<0.01)及15.8%(P<0.05);細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果提示,多種濃度的抗肝素酶B淋巴細(xì)胞表位MAP抗體在無ECM存在的情況下,并不能直接影響HCC97H細(xì)胞的遷徙能力,各組劃痕愈合率相比較無顯著性差異(P>0.05);Transwell試驗結(jié)果顯示,與未經(jīng)免疫兔IgG對照組相比,在加入終濃度100μg/ml及50μg/ml抗肝素酶MAP多克隆抗體的Transwell侵襲小室中,48小時穿膜細(xì)胞數(shù)抑制率分為36.

14、5%(P<0.05)及5.8%(P<0.05)。以上結(jié)果說明,抗肝素酶B細(xì)胞表位MAP抗體對HCC97H細(xì)胞生長無直接影響,但可通過抑制HCC97H細(xì)胞肝素酶活性、遏制其對ECM的降解和黏附作用來降低其侵襲性。
　　3.抗肝素酶B細(xì)胞表位MAP抗體單次給藥就能有效抑制荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤性血管生成、原位肝癌生長及肺轉(zhuǎn)移
　　過繼免疫后8周解剖荷瘤鼠,測量肝臟腫瘤體積并在顯微鏡下行肝癌肺微轉(zhuǎn)移灶計數(shù),結(jié)果顯示,注射抗肝素酶B細(xì)胞表

15、位MAP抗體各組的原位肝癌體積及肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目都明顯小于未經(jīng)免疫兔IgG對照組(P<0.01)及希羅達(dá)陽性對照組(P<0.05),且其作用具有一定的劑量(濃度)依賴性,但多次給藥相對于單次給藥并無明顯優(yōu)勢(P>0.05);ELISA法檢測裸鼠血清中VEGF及bFGF濃度,結(jié)果顯示,抗肝素酶B細(xì)胞表位MAP抗體各組的血清VEGF及bFGF濃度都明顯低于未經(jīng)免疫兔 IgG對照組(P<0.05)及希羅達(dá)陽性對照組(P<0.05),且其作用顯示了

16、一定的劑量依賴性,但多次給藥相對于單次給藥并未能進(jìn)一步降低血清VEGF或bFGF的濃度(P>0.05);免疫組化染色半定量比較及Image pro plus軟件分析結(jié)果顯示,抗肝素酶B細(xì)胞表位MAP抗體各組肝癌組織的VEGF、bFGF及CD34的表達(dá)都明顯低于未經(jīng)免疫兔IgG對照組及希羅達(dá)陽性對照組,但增加給藥次數(shù)并未能進(jìn)一步降低VEGF、bFGF或CD34在肝癌組織的表達(dá)。以上結(jié)果說明,肝素酶B細(xì)胞表位MAP抗體所誘生的特異性抗體在荷

17、瘤裸鼠體內(nèi)單次給藥就能有效抑制原發(fā)性肝癌的生長及肺轉(zhuǎn)移,并能抑制VEGF及bFGF的釋放及表達(dá)、減少微血管密度(Micro vessel density,MVD),其作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,而非頻率依賴性。
　　4.肝素酶B細(xì)胞表位MAP疫苗動物體內(nèi)應(yīng)用具有良好的安全性
　　WHBY兔主動免疫前及免疫后4周采血,行外周血細(xì)胞計數(shù)比較,結(jié)果顯示,其血淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞及血小板計數(shù)在免疫前后均無顯著性差異(P>0.05);實(shí)驗結(jié)

18、束前處死裸鼠并采血,行各組血細(xì)胞計數(shù)比較,結(jié)果顯示各組間淋巴細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)及血小板計數(shù)值無顯著性差異(P>0.05);WHBY兔免疫后外周血涂片高倍(1000×)鏡下觀察,白細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常,其脾臟、淺表淋巴結(jié)組織病理切片 H&E染色鏡下觀察亦無明顯病理性改變;各組裸鼠外周血涂片高倍(1000×)鏡下觀察,白細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞形態(tài)也未見明顯異常,裸鼠脾臟病理切片H&E染色鏡下觀察未見明顯病理性改變。
　

19、　【結(jié)論】
　　本研究證實(shí)了肝素酶B淋巴細(xì)胞表位MAP疫苗在活體內(nèi)具有抗原發(fā)性肝癌生長及抑制其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(肺轉(zhuǎn)移)的作用,且其作用效果明顯優(yōu)于希羅達(dá)陽性對照;該疫苗體內(nèi)抗肝癌生長及抑制肝癌轉(zhuǎn)移的可能作用機(jī)理為:通過在活體內(nèi)誘生出的特異性多克隆抗體,抑制HCC97H肝癌細(xì)胞肝素酶活性,從而降低其侵襲性;抑制VEGF和bFGF的釋放和表達(dá)、降低微血管密度(MVD)從而減少血管生成。該人工合成的肝素酶B細(xì)胞表位MAP疫苗活體內(nèi)應(yīng)用具有免疫