MBD2基因缺陷促進(jìn)血管生成并改善小鼠下肢缺血損傷.pdf

1、本文對(duì)MBD2基因缺陷促進(jìn)血管生成并改善小鼠下肢缺血損傷問題進(jìn)行了研究。主要內(nèi)容如下：
　　 ㈠概述。內(nèi)皮細(xì)胞是組織血管的組成成分，擔(dān)任了調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸以及激活血液中細(xì)胞和分子物質(zhì)的多項(xiàng)生物學(xué)潛能。內(nèi)皮細(xì)胞能起著控制血管功能的作用，是血管疾病最初也是最關(guān)鍵的防御。由于血管疾病病因同時(shí)涉及了遺傳因素和表觀遺傳學(xué)因素，找到一個(gè)最小副作用的最優(yōu)的治療靶點(diǎn)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。作為表觀遺傳學(xué)的重要組成成分，DNA甲基化的改變?cè)谟醒芗膊〉?/p>

2、病人和動(dòng)物體內(nèi)很常見。近來研究表明DNA甲基化可以作為反映環(huán)境對(duì)不同種類的細(xì)胞影響的“印記”。這種DNA甲基化印記可以被一個(gè)甲基化-CpG結(jié)合域（MBD）的保守家族所“閱讀”。這個(gè)保守家族包括MBD1，MBD2，MBD3，MBD4和MeCP2五個(gè)成員。它們與其他一些蛋白一起影響著DNA甲基化引起的轉(zhuǎn)錄抑制和（或）異染色質(zhì)的形成。因此，他們影響著表觀遺傳基因組的生成，維持和相互作用。每個(gè)MBD家族成員可以以它與甲基化DNA結(jié)合的親和力來區(qū)

3、分，其中親和力最強(qiáng)的是MBD2，而MBD3則不能結(jié)合甲基化的DNA。除了MBD3外，MeCP2，MBD1，MBD2和MBD4缺陷的小鼠都可以存活。其中MBD2缺陷的小鼠除了雌性小鼠會(huì)有哺乳行為的缺陷外，顯示幾乎完全正常的表型，表明MBD2有極大可能性作為表觀遺傳學(xué)治療的優(yōu)良靶點(diǎn)。我們想檢測(cè)MBD2在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。我們?cè)O(shè)想，作為一個(gè)關(guān)鍵的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)因子，MBD2能夠改變內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，并且在內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和血管生成方面

4、起調(diào)節(jié)作用。我們發(fā)現(xiàn)抑制MBD2的表達(dá)可以顯著地增強(qiáng)血管生成，抑制雙氧水引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。MBD2基因缺陷小鼠顯著改善下肢缺血之后的血流恢復(fù)?？紤]到生理狀態(tài)下MBD2基因缺陷小鼠幾乎正常的表型，我們的結(jié)果表明MBD2有潛力作為治療和預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞損傷的靶點(diǎn)。
　　 ㈡MBD2表達(dá)降低能保護(hù)雙氧水誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并促進(jìn)血管生成。首先用MBD2干擾RNA或?qū)φ崭蓴_RNA轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），檢測(cè)降低MBD2表達(dá)對(duì)內(nèi)皮

5、細(xì)胞功能的影響。Western blot檢測(cè)到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MBD2，并且檢測(cè)到MBD2干擾RNA轉(zhuǎn)染后能劑量依賴性地抑制MBD2的表達(dá)。當(dāng)用100 nmol/l的MBD2干擾RNA轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，MBD2的表達(dá)幾乎被完全抑制。然后我們將干擾RNA轉(zhuǎn)染后的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞種到減生長(zhǎng)因子martigel預(yù)處理過的培養(yǎng)板。MBD2表達(dá)降低后明顯增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞在減生長(zhǎng)因子matrigel里成管的形成。我們于培養(yǎng)4小時(shí)后即可觀察到MB

6、D2干擾RNA轉(zhuǎn)染后的內(nèi)皮細(xì)胞有管狀的形成，而對(duì)照干擾RNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞此時(shí)還沒有明顯的管狀形成。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，MBD2干擾RNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞成管數(shù)量在單位面積里明顯超過對(duì)照RNA轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞成管數(shù)量。為檢測(cè)MBD2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用氚三標(biāo)記包嘧啶法進(jìn)行了增殖實(shí)驗(yàn)。我們于16小時(shí)后發(fā)現(xiàn)MBD2干擾RNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖明顯比對(duì)照RNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞快。接著我們又檢測(cè)了MBD2干擾RNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，在RNA干

7、擾后24小時(shí)后，我們用0.2mM的雙氧水又孵育了24小時(shí)。我們發(fā)現(xiàn)MBD2干擾RNA轉(zhuǎn)染后降低了雙氧水引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。這些都表明了MBD2負(fù)調(diào)節(jié)血管生成并能促進(jìn)雙氧水誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　 ㈢MBD2基因缺陷小鼠較正常小鼠顯著促進(jìn)后肢缺血后的恢復(fù)。臨床上心血管疾病病人預(yù)后不佳與其對(duì)缺血反應(yīng)的血管生成能力低下有關(guān)。鑒于我們觀察到MBD2基因負(fù)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，我們檢測(cè)了它在缺血損傷后對(duì)血流灌注的影響。我們首先驗(yàn)證了MB

8、D2敲除小鼠的血管中MBD2蛋白表達(dá)降低。接著，我們給野生型小鼠做了股動(dòng)脈結(jié)扎摘除術(shù)使之下肢缺血，并在不同的缺血時(shí)間后檢測(cè)MBD2蛋白的表達(dá)是否有改變。在生理狀態(tài)下，只能檢測(cè)到較低水平的MBD2.但是在缺血發(fā)生后，MBD2蛋白水平增加了，并且在缺血后第四天左右達(dá)到最高，之后MBD2水平又慢慢回落且在術(shù)后14天左右回到相對(duì)低的水平。免疫染色顯示MBD2表達(dá)主要在血管上并且主要在內(nèi)皮細(xì)胞上（與CD31表達(dá)大部分重合）。下肢缺血后的免疫染色顯

9、示MBD2表達(dá)增高同時(shí)伴隨著CD31表達(dá)也增高，說明內(nèi)皮細(xì)胞在缺血后的成管能力可能與MBD2表達(dá)水平相關(guān)。為了確定MBD2基因在缺血后血流恢復(fù)中的作用，我們對(duì)MBD2敲除小鼠和對(duì)照小鼠進(jìn)行了單側(cè)后肢缺血手術(shù)。手術(shù)后所有小鼠都存活了。術(shù)前和術(shù)后我們用激光多普勒探測(cè)缺血側(cè)和非缺血側(cè)下肢的血流灌注情況。MBD2敲除小鼠在術(shù)后第2天就有小部分的血流回復(fù)，術(shù)后第七天就恢復(fù)到了50％，術(shù)后第14天幾乎完全恢復(fù)。但是野生型小鼠直到第4天才有小部分的血

10、流恢復(fù)，術(shù)后第7天才恢復(fù)了30％左右，術(shù)后第14天才恢復(fù)了60％左右。為檢測(cè)新生血管的差別，我們檢測(cè)了毛細(xì)血管（CD31陽(yáng)性細(xì)胞）和小動(dòng)脈（平滑肌α-actin陽(yáng)性細(xì)胞）形成。我們發(fā)現(xiàn)MBD2敲除小鼠的切片中CD31陽(yáng)性細(xì)胞和平滑肌α-actin陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組增多?？偟膩碚f，我們的結(jié)果顯示MBD2表達(dá)降低可以促進(jìn)缺血后毛細(xì)血管生成和小動(dòng)脈血管生成進(jìn)一步促進(jìn)缺血后血流灌注的恢復(fù)。
　　 ㈣抑制MBD2表達(dá)可以激活內(nèi)皮細(xì)胞生存和促

11、血管生成信號(hào)通路。檢測(cè)了兩個(gè)最主要的內(nèi)皮細(xì)胞生存信號(hào)通路：ERK和AKT。我們用MBD2特異性siRNA或者對(duì)照的siRNA轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞降低MBD2表達(dá)水平，然后檢測(cè)兩組細(xì)胞磷酸化的ERK和AKT水平。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞磷酸化AKT水平并無明顯改變，但是轉(zhuǎn)染后MBD2組磷酸化ERK表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高。鑒于磷酸化ERK能穩(wěn)定BCL-2，而BCL-2是一個(gè)抗凋亡的蛋白，我們又檢測(cè)了雙氧水處理之后兩組BCL-2表達(dá)水平，結(jié)果

12、發(fā)現(xiàn)MBD siRNA轉(zhuǎn)染組BCL-2表達(dá)水平增高。進(jìn)一步，我們檢測(cè)了MBD2敲除小鼠和正常小鼠中磷酸化ERK和BCL-2等表達(dá)，得到相似的結(jié)論。令人驚奇的是，MBD2表達(dá)降低后并不影響抗氧化應(yīng)激的兩個(gè)主要酶：MnSOD和Cu/Zn SOD的表達(dá)。為找尋MBD2負(fù)調(diào)節(jié)血管生成的機(jī)制，我們檢測(cè)了兩大關(guān)鍵因子eNOS和VEGF-R2的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)MBD2 siRNA轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后增加了內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化eNOS，總eNOS以及VEGF

13、-R2表達(dá)水平。MBD2敲除小鼠以及對(duì)照小鼠的血管也顯示了類似的結(jié)果。我們還進(jìn)一步檢測(cè)了p38 MAPK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MBD2 siRNA組和MBD2敲除小鼠血管中磷酸化p38顯著增高?？偟膩碚f，抑制MBD2表達(dá)很可能是通過激活細(xì)胞生存和促血管生成信號(hào)通路來增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞生存和促血管生成。
　　 ㈤eNOS協(xié)同VEGF-R2促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生存和血管生成。為了闡述上述信號(hào)分子之間的聯(lián)系，我們使用VEGF-R2或eNOS的抑制劑來處理內(nèi)皮

14、細(xì)胞觀察生存和血管生成信號(hào)通路的反應(yīng)。VEGF刺激不影響總VEGF-R2、總eNOS和總ERK1/2的表達(dá)，但能促進(jìn)VEGF-R2、eNOS和ERK1/2的活化并增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)。和預(yù)想的一樣，VEGF-R2中和抗體或者化學(xué)抑制劑（SU1498）抑制了VEGF引起的VEGF-R2、ERK1/2和BCL-2活化。eNOS的活化也被中度抑制。而用eNOS抑制劑L-NAME處理內(nèi)皮細(xì)胞再用VEGF處理后，不僅 磷酸化eNOS活化降低，同時(shí)

15、VEGF-R2、ERK1/2和BCL-2活化也顯著降低。這些結(jié)果表明ERK1/2和BCL-2是eNOS和VEGF-R2的下游，并且eNOS協(xié)同VEGF-R2一起增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞生存和血管生成通路。為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論，接下來我們?cè)谙轮毖中g(shù)后MBD2敲除小鼠和對(duì)照小鼠的飲水中放入或不放入L-NAME并觀察四組小鼠術(shù)后血流恢復(fù)情況。給予L-NAME后MBD2敲除小鼠和正常小鼠血流恢復(fù)無明顯差別，說明L-NAME能消除MBD2基因缺陷引起的血

16、流恢復(fù)變化。
　　 ㈥MBD2可以結(jié)合到eNOS和VEGF-R2啟動(dòng)子區(qū)的高GC含量區(qū)域。上述結(jié)果中MBD2表達(dá)降低增高了eNOS和 VEGF-R2的表達(dá)，而且以往的研究也表明甲基化對(duì)eNOS和VEGF-R2的表達(dá)有作用，促使我們?nèi)ヌ剿鱉BD2是不是直接結(jié)合到eNOS和VEGF-R2啟動(dòng)子區(qū)從而抑制了它們的表達(dá)。雖然在eNOS啟動(dòng)子區(qū)沒有明顯的CpG島，但我們發(fā)現(xiàn)在5’非編碼區(qū)有一個(gè)GC富含區(qū)域。相對(duì)而言，我們?cè)赩EGF-R2啟

17、動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)典型的CpG島。接著，我們用染色體免疫共沉淀法獲得了MBD2-DNA復(fù)合物。然后我們針對(duì)eNOS啟動(dòng)子區(qū)/5’非編碼區(qū)設(shè)計(jì)了覆蓋全長(zhǎng)的多對(duì)引物，針對(duì)VEGF-R2的兩個(gè)CpG島設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，并用這些引物去擴(kuò)增MBD2結(jié)合的DNA片段。覆蓋eNOS啟動(dòng)子區(qū)的8對(duì)引物都沒有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，而覆蓋eNOS的5’端非編碼區(qū)的兩對(duì)引物得到了陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物。另人驚訝的是，針對(duì)VEGF-R2的CpG島設(shè)計(jì)的三對(duì)引物中，只有覆蓋-64到+

18、167區(qū)域的第三對(duì)引物得到了擴(kuò)增產(chǎn)物。為進(jìn)一步證實(shí)我們的推論，我們首先用對(duì)照siRNA或MBD2 siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC 24小時(shí)，然后再用5-azadc（DNA甲基化酶抑制劑）處理細(xì)胞24小時(shí)，檢測(cè)eNOS和VEGF-R2的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)5-azadc處理后，MBD2表達(dá)降低帶來的eNOS和VEGF-R2增高效應(yīng)被抑制了，說明這其中有甲基化的參與。接著，我們用染色體免疫共沉淀法獲得了MBD2-DNA復(fù)合物。然后我們針對(duì)eNOS啟動(dòng)子

19、區(qū)/5’非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)了覆蓋全長(zhǎng)的多對(duì)引物，針對(duì)VEGF-R2的兩個(gè)CpG島設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，并用這些引物去擴(kuò)增MBD2結(jié)合的DNA片段。覆蓋eNOS啟動(dòng)子區(qū)的8對(duì)引物都沒有得到擴(kuò)增產(chǎn)物，而覆蓋eNOS的5’端非翻譯區(qū)的兩對(duì)引物得到了陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物。令人驚訝的是，針對(duì)VEGF-R2的CpG島設(shè)計(jì)的三對(duì)引物中，只有覆蓋-64到+167區(qū)域的第三對(duì)引物得到了擴(kuò)增產(chǎn)物。為進(jìn)一步證實(shí)上述CHIP結(jié)果，我們特別用bisulfite DNA測(cè)序方法檢測(cè)了

20、eNOS 5’端區(qū)域的13個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況。我們發(fā)現(xiàn)在生理情況下，eNOS 5’端區(qū)域的13個(gè)CpG位點(diǎn)存在甲基化，并且在模擬缺血（缺氧加血清饑餓）刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞DNA總體甲基化程度增高。我們接著又做了EMSA實(shí)驗(yàn)來證明MBD2能夠結(jié)合到eNOS的這個(gè)區(qū)域的甲基化CpG上。生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物（+31 to+197）首先取一部分被SssI甲基化酶處理，然后我們用經(jīng)甲基化酶處理或者未經(jīng)甲基化酶處理的PCR產(chǎn)物作為探針去檢測(cè)MB

21、D2的結(jié)合活性。我們發(fā)現(xiàn)MBD2可以結(jié)合到那些甲基化過后的PCR產(chǎn)物，并且親和力很高。為進(jìn)一步論證MBD2結(jié)合到那些甲基化后的CpG元件后，抑制了eNOS的轉(zhuǎn)錄活性，我們將eNOS啟動(dòng)子區(qū)（-1700到+350）克隆進(jìn)pGL-2載體（pGL-eNOS）.我們還構(gòu)建了一個(gè)突變的eNOS啟動(dòng)子報(bào)告載體（pGL-eNOSm），在構(gòu)建的時(shí)候，-200到+300這一段區(qū)域CpG中的C都突變?yōu)锳。接著我們將pcDNA-MBD2載體、pGL-TK載體

22、和pGL-eNOS 載體或者pcDNA-MBD2載體、pGL-TK載體和pGL-eNOSm 載體分別共轉(zhuǎn)HUVEC細(xì)胞做熒光報(bào)告基因檢測(cè)。我們的結(jié)果顯示只有甲基化后的載體報(bào)告子顯示有熒光活性的差異，表現(xiàn)在CpG元件缺失后報(bào)告熒光的活性增加近一倍。相對(duì)而言，在沒有被甲基化的情況下，pGL-eNOS載體和pGL-eNOSm載體的報(bào)告熒光活性沒有顯著差異。這些結(jié)果都表明了MBD2直接結(jié)合到eNOS和VEGF-R2的啟動(dòng)子區(qū)域的CpG元件上，并

23、抑制了它們的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 ㈦MBD2對(duì)eNOS轉(zhuǎn)錄過程的抑制只限于內(nèi)皮細(xì)胞，并且這個(gè)過程中涉及了染色體重構(gòu)。有報(bào)導(dǎo)表明MBD2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與HDACs引起的染色體重構(gòu)有關(guān)。為了檢測(cè)MBD2對(duì)eNOS轉(zhuǎn)錄的抑制是否也涉及了染色體重構(gòu)，我們?cè)贛BD2特異性siRNA和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染后的內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入TSA。TSA是組氨酸去乙?；福℉DAC）的抑制劑，但是在內(nèi)皮細(xì)胞中加入TSA會(huì)引起eNOS表達(dá)的降低。另人驚訝的是

24、，加入TSA后MBD2特異性siRNA轉(zhuǎn)染組和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染組 eNOS的表達(dá)變得沒有明顯差別了，說明TSA處理消除了MBD2特異性siRNA增強(qiáng)eNOS表達(dá)的作用。TSA處理在非內(nèi)皮細(xì)胞中能誘發(fā)eNOS表達(dá)，而降低MBD2表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞能引起eNOS表達(dá)增加，促使我們?nèi)パ芯縈BD2表達(dá)降低對(duì)非內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)的作用。我們將MBD2特異性siRNA和對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞中加入TSA或DMSO（

25、對(duì)照溶劑）后檢測(cè)eNOS的表達(dá)。令人驚訝的是，在Hela細(xì)胞中TSA能誘發(fā)eNOS表達(dá)，而在Hela細(xì)胞中降低MBD2蛋白表達(dá)并沒有誘發(fā)eNOS表達(dá)。我們用HEK293細(xì)胞也得到了相似的結(jié)論。接著我們將MBD2敲除小鼠和對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞分離出來，并用TSA或者DMSO（對(duì)照溶劑）處理，檢測(cè)eNOS表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TSA處理可以誘發(fā)脾細(xì)胞表達(dá)eNOS，而DMSO處理的MBD2敲除小鼠和對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞都不表達(dá)eNOS。從以上結(jié)果，我們得出了這樣

26、一個(gè)結(jié)論，MBD2對(duì)eNOS轉(zhuǎn)錄抑制僅限于內(nèi)皮細(xì)胞，且此過程涉及了HDACs和染色體重構(gòu)。
　　 ㈧結(jié)論：⑴研究證明MBD2在下肢缺血后的血流恢復(fù)中起重要作用；⑵MBD2表達(dá)降低能保護(hù)雙氧水誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并促進(jìn)血管生成；⑶抑制MBD2表達(dá)可以激活內(nèi)皮細(xì)胞生存和促血管生成信號(hào)通路；⑷MBD2可以結(jié)合到eNOS和VEGF-R2啟動(dòng)子區(qū)的高GC含量區(qū)域；⑸MBD2對(duì)eNOS轉(zhuǎn)錄過程的抑制只限于內(nèi)皮細(xì)胞，并且這個(gè)過程中涉及了染色體重