mBD2與HA1融合基因真核表達載體的構(gòu)建及其免疫保護性研究.pdf

1、甲型流感病毒曾在世界上多次發(fā)生大規(guī)模的流感暴發(fā)流行，目前對流感尚無特效藥物進行治療，接種流感疫苗是易感者預防流感的最佳選擇，核酸疫苗是當前流感疫苗研究的方向與熱點。流感病毒血凝素(hemagglutinin．HA)是流感病毒的主要保護性抗原，能刺激機體產(chǎn)生中和性抗體，此類抗體具有中和病毒和防止病毒進入靶細胞的作用，可中斷病毒的復制。HA由HA1重鏈和HA2輕鏈相連構(gòu)成。HA的5個抗原決定簇主要都位于HA1區(qū)，因而流感亞單位疫苗的靶標就首

2、選HA1區(qū)。小鼠β-防御素2(mBD2)是一種內(nèi)源性的抗菌肽，對非成熟的DC細胞具有趨化作用，能活化APC，增強機體的免疫作用，因此可以作為一種天然的免疫佐劑。 本研究的目的:構(gòu)建mBD2與HAl融合的真核表達載體(pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1)，并檢測其在HEK293細胞中的表達，觀察pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1免疫小鼠后對流感病毒攻擊的保護力，研究mBD2作為免疫佐劑的可行性。 方法:用PCR

3、技術分別從構(gòu)建好的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中擴增出mBD2與HAl基因片段，再用重疊延伸PCR法(overlap-PCR)將mBD2與HA1通過一段柔性多肽接頭Gly<,4>Ser融合為mBD2-HA1。將mBD2-HA1融合基因插入真核表達載體pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E coli JM109并篩選陽性克隆。經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定正確后，用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/m

4、BD2-HA1轉(zhuǎn)染HEK293細胞，用課題組制備的兔抗流感病毒血清作為一抗，F(xiàn)ITC熒光素標記的羊抗兔IgG為二抗，通過免疫熒光檢測融合蛋白的真核表達情況。為了研究重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1對甲型流感病毒的免疫保護作用，我們以SPF級BALB/c小鼠為實驗動物，用pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1、pcDNA3.1(+)/HA1和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒DNA分別免疫小鼠，一共免疫兩次，每次間隔三周。在第二

5、次加強免疫前，用斷尾法從小鼠尾部取血；第二次免疫后10d(病毒攻擊后3d)，再次取血，并收集血清檢測抗.HA抗體。加強免疫后一周，用致死量(10×LD50)滴鼻攻擊小鼠，觀測動物的體重變化及存活率。綜合以上幾個方面評價重組質(zhì)粒的免疫保護效果。 結(jié)果:PCR法分別從質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中擴增出了mBD2與HA1基因片段，并且用重疊延伸PCR法成功將mBD2與HAl通過一段柔性多肽接頭

6、Gly<,4>Ser融合為mBD2-HA1。重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1經(jīng)雙酶切電泳后出現(xiàn)大小約1.2kb的目的條帶,PCR鑒定也出現(xiàn)了相同大小的條帶，目的片段經(jīng)測序和將測序結(jié)果進行Blast比對，證實了克隆片段是正確的。免疫熒光檢測結(jié)果表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1體外實驗能夠在HEK293細胞中表達mBD2-HA1的融合蛋白。動物實驗結(jié)果表明，pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒對照組的小鼠7d內(nèi)全

7、部死亡，pcDNA3.1(+)/HA1免疫組的小鼠保護率為50％，而pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1組的小鼠保護率為90％；與單獨免疫pcDNA3.1(+)/HA1相比，mBD2-HA1融合基因DNA免疫小鼠后，誘導出了更高的抗-HA抗體，保護率也更高，并且體重丟失明顯減少。 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了mBD2-HA1融合基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1，該質(zhì)粒能在真核細胞中表達融合蛋白；經(jīng)動物實驗