PLGA-S1P促進小鼠下肢缺血模型血管新生和血流恢復(fù)作用.pdf

1、在發(fā)達(dá)國家,建立一個有效的治療血管缺血的治療方法,是一項具有挑戰(zhàn)性的研究。研究至今,人們創(chuàng)立了一些治療方法,比如給予一些生長因子或給予一些骨髓來源細(xì)胞的治療,然而結(jié)果不是十分令人滿意。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一種具有重要生物學(xué)活性的溶血磷脂,主要來源于細(xì)胞膜鞘磷脂的分解代謝,參與S1P生物合成調(diào)節(jié)的酶主要為鞘磷脂酶,神經(jīng)酰胺酶,鞘胺醇激酶和S1P裂解酶?，F(xiàn)在人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)S1P作用于5種S1P受體:S1P1,S1P2,S1P3,S1P4

2、和S1P5。一些機制研究表明S1P1受體和S1P3受體通過Gi來上調(diào)Rac引起細(xì)胞的趨化作用,S1P2受體通過G12/13來激活Rho,從而下調(diào)Rac,進而抑制了細(xì)胞的趨化作用。S1P1和S1P3表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞,S1P2和SlP3表達(dá)于平滑肌細(xì)胞,S1P作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞,從而刺激細(xì)胞遷移和血管形成,以及在發(fā)育血管新生中起著重要的作用。S1P信號通路參與了以下的生理功能:血管和神經(jīng)的發(fā)育,淋巴細(xì)胞再循環(huán),維持內(nèi)皮功能,內(nèi)耳

3、功能和蛻膜形成。一些體內(nèi)外實驗表明了S1P對血管新生的作用:體外實驗表明S1P可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖、刺激管腔形成;體內(nèi)實驗表明S1P可以刺激植入的基質(zhì)膠發(fā)生血管新生、S1P1基因敲除鼠表現(xiàn)為血管成熟受損以及胚胎期死亡。因此我們研發(fā)了以聚乳酸乙醇酸共聚物包被的1-磷酸鞘氨醇微粒(PLGA-S1P),這種微粒是可以生物降解的并且可以持續(xù)釋放1-磷酸鞘氨醇,并且研究了PLGA-S1P微粒對于小鼠下肢缺血模型的新生血管生成的作用。

4、>　　 方法：首先制備PLGA微粒以及小鼠下肢缺血模型;比較了3種不同的給藥間隔時間,如一次給藥,每隔6日給藥和每隔3日給藥對于小鼠下肢缺血模型的新生血管生成的作用,在這3種給藥方式中,總的S1P量一致。我們還比較了4種不同藥物濃度對血流恢復(fù)的作用;VEGF和PLGA-S1P對小鼠缺血下肢血流恢復(fù)的作用;通過二重免疫熒光染色、檢測血管生長因子mRNA表達(dá)水平、Akt和ERK的磷酸化,以及內(nèi)皮一氧化氮合酶的磷酸化水平;給予eNOS抑制劑

5、;骨髓移植實驗;免疫組化檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、研究結(jié)果顯示3日一次肌內(nèi)注射PLGA-S1P與一次性肌內(nèi)注射或每6日一次肌內(nèi)注射相比,為最佳給藥間隔。
　　 2、在術(shù)后28天PLGA-S1P劑量依賴性的刺激C57BL/6小鼠缺血下肢的血流恢復(fù)。Balb/c小鼠通常在股動脈結(jié)扎后表現(xiàn)為由于血流恢復(fù)緩慢而導(dǎo)致的下肢壞死和運動功能不良,注射PLGA-S1P可以刺激缺血下肢的血流恢復(fù)以及減輕缺血下肢的壞死和減輕運

6、動功能不良。
　　 3、由于局部注射血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)可以導(dǎo)致血管通透性增高,進而引起組織水腫,從而限制了其在臨床上的應(yīng)用,因此我們比較了VEGF和PLGA-S1P對小鼠缺血下肢血流恢復(fù)的作用,研究結(jié)果表明單獨應(yīng)用PLGA-S1P不但沒有引起缺血下肢的水腫,反而可以抑制由VEGF導(dǎo)致的組織水腫。
　　 4、二重免疫熒光染色結(jié)果表明,局部注射PLGA-S1P不僅可以增加缺血肌肉的微血管密度、促進大血管的形成,還可

7、以促進周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞對新生血管的包被,因此增加了新生血管的穩(wěn)定性,抑制新生血管的退化。
　　 5、我們發(fā)現(xiàn)下肢缺血可以增加白介素-1(IL-1)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-1(TGF-1)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)和血小板衍生生長因子-B(PDGF-B)的表達(dá)水平,而PLGA-S1P可以增加血管生成素-1(angiopoietin-1)、HGF、IL-1和SDF-1的表達(dá)水平。
　　 6、我們

8、研究了NOS在PLGA-S1P對下肢缺血動物模型新生血管形成的作用,一些體外實驗表明在血管內(nèi)皮細(xì)胞,S1P活化AKT來刺激eNOS是通過Akt介導(dǎo)的eNOS磷酸化;最近也有研究結(jié)果表明ERK1/2也是通過eNOS磷酸化來刺激eNOS的,eNOS活化必然導(dǎo)致NO產(chǎn)生,從而加速下肢缺血動物模型的血流恢復(fù)情況,實驗結(jié)果表明局部注射PLGA-S1P可以刺激缺血肌肉組織的蛋白激酶Akt和ERK的磷酸化,以及內(nèi)皮一氧化氮合酶的磷酸化。
　　

9、 7、為了進一步驗證eNOS對小鼠缺血模型血流恢復(fù)的作用,我們?nèi)斫o與Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME),eNOS抑制劑,研究結(jié)果顯示L-NAME可以降低PLGA-S1P刺激血流恢復(fù)的情況,同時免疫組化結(jié)果進一步表明:全身給與L-NAME,具有抑制PLGA-S1P刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞陽性的微血管密度的趨勢。
　　 8、由于骨髓來源的細(xì)胞可以分泌一些生長因子以及分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞,因此我們通過骨髓移植實驗來觀察PLG

10、A-S1P對骨髓來源細(xì)胞的作用,我們可以看到PLGA-S1P可以誘導(dǎo)GFP陽性的骨髓來源細(xì)胞的浸潤;免疫組化檢測結(jié)果顯示:PLGA-S1P可以增加下肢缺血組織CD45標(biāo)記的全骨髓細(xì)胞的浸潤,CDllB標(biāo)記的單核系細(xì)胞浸潤和Gr-1標(biāo)記的中性粒細(xì)胞的浸潤。
　　 結(jié)論：上述數(shù)據(jù)表明了:
　　 1、每隔3日局部給予PLGA-S1P可以促進C57BL/6小鼠下肢缺血模型的血流恢復(fù),微血管數(shù)的增加以及促進血管成熟化;
　　

11、 2、每隔3日局部給予PLGA-S1P可以促進Balb/c小鼠下肢缺血模型的血流恢復(fù),減少組織壞死,促進下肢的運動功能;
　　 3、單獨給與PLGA-S1P緩釋微粒并未引起下肢水腫,并且可以抑制VEGF引起的組織水腫;
　　 4、PLGA-S1P促進血管新生的機制是通過促進Akt和ERK磷酸化以及eNOS的磷酸化,上調(diào)一些生長因子的表達(dá)以及誘導(dǎo)骨髓來源細(xì)胞的聚集。
　　 綜上所述,局部注射PLGA-S1P緩釋微