bFGF和G-CSF促進(jìn)兔缺血后肢血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、外周動(dòng)脈閉塞或狹窄引起的肢體缺血性疾病(下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥、糖尿病足、血栓性脈管炎等)是外科常見的致殘性疾病，靜息痛、皮膚潰瘍或壞疽是下肢缺血性疾病典型的臨床表現(xiàn)，以高發(fā)生率、高截肢率和高死亡率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。隨著我國飲食結(jié)構(gòu)的改變(攝入含脂食物增多)、人均壽命的延長以及檢查診斷技術(shù)的改進(jìn)，下肢缺血性疾病發(fā)病率逐年升高，己經(jīng)成為危害人類健康的嚴(yán)重疾病。目前針對(duì)下肢缺血性疾病主要手段是藥物、外科手術(shù)以及介入腔內(nèi)治療等。但是對(duì)于遠(yuǎn)端

2、流出道嚴(yán)重狹窄尤其是合并糖尿病的患者往往沒有手術(shù)機(jī)會(huì)，目前還缺乏令人滿意的治療方法。應(yīng)用各種方法和手段促進(jìn)新生血管生成，促進(jìn)缺血肢體側(cè)枝循環(huán)的建立，可能是有效可行的治療方法之一。 血管新生(angiogenesis)原指在已存在血管床的基礎(chǔ)上血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移并重塑形成新的成熟血管，即從先前存在的血管上出芽生成新生毛細(xì)血管的過程。人體組織的正常生長均需要血管新生，成年女性子宮內(nèi)膜的反復(fù)重建也是反復(fù)血管新生的過程；由于動(dòng)脈狹窄

3、或閉塞而引起組織、器官處于缺血狀態(tài)，機(jī)體會(huì)形成代償性的側(cè)支血管，此均為生理性的血管新生。血管新生療法，原是指通過應(yīng)用外源血管生長因子(血管內(nèi)皮生長因子VEGF，堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF等)或其基因，以促進(jìn)缺血組織內(nèi)血管新生和側(cè)支血管的形成，使缺血組織的缺血狀態(tài)獲得改善的治療方法。血管發(fā)生(vasculogenesis)指發(fā)生在胚胎發(fā)育時(shí)期的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)形成原始血管的過程。然而近年來發(fā)現(xiàn)在成年體內(nèi)也存在EPC，主要分布于

4、骨髓，循環(huán)外周血中也含有EPC，但含量極少。循環(huán)外周血中的EPC同樣參與后天的血管新生。這就加深了對(duì)血管新生的認(rèn)識(shí)，擴(kuò)大了血管新生的概念。有學(xué)者認(rèn)為在缺血、創(chuàng)傷等因素或某些因子動(dòng)員下，骨髓EPC大量復(fù)制并釋放至外周血液，定向遷移至缺血部位，定向增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與缺血組織的血管新生。并認(rèn)為VEGF、bFGF、粒單．集落刺激因子(G-CSF)等促血管生成作用實(shí)質(zhì)也是動(dòng)員骨髓EPC的遷移、增殖、分化，而發(fā)揮血管新生效應(yīng)。也有人認(rèn)為血

5、管新生和血管發(fā)生同時(shí)存在，共同改善局部缺血狀態(tài)。各種血管生長因子控制著血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移，調(diào)節(jié)著血管新生整個(gè)過程的各個(gè)階段。在組織缺血缺氧的情況下，組織產(chǎn)生各種促血管新生的因子的能力增強(qiáng)，并且可以動(dòng)員循環(huán)中的細(xì)胞共同參與新血管的形成。bFGF被認(rèn)為是體內(nèi)最為有效的促血管生長因子之一。多個(gè)研究還發(fā)現(xiàn)bFGF有促進(jìn)動(dòng)脈生成的作用。不少學(xué)者應(yīng)用bFGF基因研究血管新生，但隨著蛋白備制、分離、提純技術(shù)的發(fā)展，逐漸多的學(xué)者開始應(yīng)用蛋白

6、進(jìn)行研究。研究表明，心肌梗死后內(nèi)源性bFGF和VEGF增加。但bFGF和VEGF增加的量不足且時(shí)間短暫，在缺血組織內(nèi)適時(shí)適量地增加局部外源性bFGF和VEGF的量是近年來研究的熱點(diǎn)。骨髓干細(xì)胞CD34<'+>細(xì)胞可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，而且干細(xì)胞能分泌如bFGF和促使血管管腔內(nèi)皮化的細(xì)胞因子。bFGF等血管生長因子又可以促進(jìn)干細(xì)胞增殖并向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖維酶原激活物和基質(zhì)金屬蛋白酶，從而降解基質(zhì)，加速新生血管的管腔結(jié)構(gòu)

7、的形成和三維立體構(gòu)像形成。很多學(xué)者已經(jīng)開始了應(yīng)用干細(xì)胞(骨髓干細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞或單個(gè)核細(xì)胞)自體移植促進(jìn)血管新生治療缺血性疾病(下肢缺血、心肌缺血等)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究，并取得了一定效果。干細(xì)胞自我移植是應(yīng)用骨髓干細(xì)胞動(dòng)員劑將骨髓干細(xì)胞“驅(qū)趕”到外周血，增加外周血中干細(xì)胞的數(shù)量，促使定向“歸巢”到缺血組織的干細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)增加，同樣可達(dá)到自體干細(xì)胞移植治療缺血性疾病的效果。 目的 本實(shí)驗(yàn)通過皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺

8、激因子(rhG-CSF)促使兔骨髓干細(xì)胞動(dòng)員；在兔骨髓干細(xì)胞動(dòng)員促使“干細(xì)胞自我移植”的基礎(chǔ)上，兔缺血后肢肌內(nèi)注射重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rh-bFGF)，觀察其對(duì)缺血組織血管新生情況的影響及兔缺血肢體的改善情況。 材料與方法 選用成年健康日本大耳白兔40只，各實(shí)驗(yàn)兔均切斷左側(cè)股動(dòng)脈及其分支，制作兔后肢缺血模型；隨機(jī)分4組；bFGF組各兔在缺血后肢肌肉內(nèi)多次注射重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rh-bFGF)(n=1

9、0)，G-CSF組兔皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)動(dòng)員兔自體干細(xì)胞釋放和遷移至缺血組織(n=10)，bFGF+G-CSF組按bFGF組和G-CSF組的方法給予bFGF蛋白和G-CSF(n=10)，對(duì)照組給予等劑量生理鹽水(n-10)。術(shù)后4周，各實(shí)驗(yàn)兔行腹主動(dòng)脈造影觀察缺血后肢側(cè)支循環(huán)血管形成情況并拍攝X線片；取內(nèi)收肌和腓腸肌肌肉行病理切片HE染色計(jì)數(shù)管腔由單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的毛細(xì)血管數(shù)目；并用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)

10、內(nèi)收肌和腓腸肌中VEGF陽性表達(dá)的血管數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSSl11.5處理。 結(jié)果 1大體觀察 麻醉意外死亡1只實(shí)驗(yàn)兔(bFGF+G-CSF組)，術(shù)后2d內(nèi)因腸梗阻死亡1只實(shí)驗(yàn)兔(bFGF組)，術(shù)后4d因腹瀉死亡1只實(shí)驗(yàn)兔(對(duì)照組)，術(shù)后5d和6d實(shí)驗(yàn)兔(G-CSF組)分別突然死亡1只，余均存活(生命體征平穩(wěn)，飲食正常，精神狀態(tài)良好等)。在觀察時(shí)間內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)兔均未見到左后肢缺血性壞死；術(shù)后4d手術(shù)切口均

11、愈合良好，無切口紅腫、滲液等；對(duì)照組3只實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后出現(xiàn)跛行，術(shù)后4天均能正常行走；對(duì)照組1只實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后第2天左后肢出現(xiàn)足背部潰瘍，約1cm×1cm大小，術(shù)后第5天潰瘍愈合；其余3組各兔未出現(xiàn)跛行或潰瘍；各實(shí)驗(yàn)兔均有不同程度的左后肢毛發(fā)脫落現(xiàn)象。 2血常規(guī)情況 G-CSF組和bFGF+G-CSF組各兔術(shù)后給予皮下注射G-CSF 10μg/kg，外周血中自細(xì)胞數(shù)量明顯上升，第6天白細(xì)胞數(shù)最高達(dá)26.2×10<'9>/L～43

12、．6x10<'9>/L，平均達(dá)35.3×10<'9>/L，且在第4天高倍鏡下就可檢測(cè)到幼稚細(xì)胞。停止皮下注射G-CSF后，外周血白細(xì)胞迅速下降，第9天基本恢復(fù)正常。其余2組各兔外周血中白細(xì)胞數(shù)量未有明顯變化5．4×10<'9>/L～10.2×10<'9>/L，平均8.6×10<'9>。皮下注射G-CSF的G-CSF組和bFGF+G-CSF組與未進(jìn)行皮下注射G-CSF的對(duì)照組和bFGF組之間第6天的白細(xì)胞數(shù)量有顯著性差異(P<0.05)；

13、而G-CSF組與bFGF+G-CSF組、對(duì)照組與bFGF組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3 側(cè)支血管數(shù)腹主動(dòng)脈造影拍攝的各x線片均顯示左側(cè)股動(dòng)脈連續(xù)性中斷，遠(yuǎn)端股動(dòng)脈均顯影良好，并出現(xiàn)不同數(shù)量的側(cè)支循環(huán)血管。bFGF+G-CSF組各X線片上均顯示出現(xiàn)密集的側(cè)支血管，呈網(wǎng)狀分布，分別連接在中斷的股動(dòng)脈之間；bFGF組顯示較密集的紊亂的側(cè)支血管；G-CSF組顯示出一定數(shù)量的側(cè)支血管形成；對(duì)照組也顯示出少量的側(cè)支血管。在腹主動(dòng)脈造影X

14、線片上經(jīng)股骨中點(diǎn)畫一條垂直于股骨縱軸的直線，記錄通過該直線顯示的血管數(shù)，定義為該實(shí)驗(yàn)兔左后肢側(cè)支血管數(shù)。bFGF+G-CSF組側(cè)支血管數(shù)多于bFGF組(P=0.034)，也多于G-CSF組(P=0.001)；bFGF組側(cè)支血管數(shù)多于G-CSF組(P=0.036)；3個(gè)實(shí)驗(yàn)組側(cè)支血管數(shù)均多于(P<0.05)。 4 毛細(xì)血管計(jì)數(shù)HE染色的兔左后肢內(nèi)收肌和腓腸肌組織切片，每一標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，在400倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)管腔由單個(gè)血

15、管內(nèi)皮細(xì)胞組成的毛細(xì)血管數(shù)目，由兩人獨(dú)立分別計(jì)數(shù)毛細(xì)血管數(shù)目，其平均值即為毛細(xì)血管數(shù)。bFGF+G-CSF組均可見滿視野由單個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的毛細(xì)血管分布于肌束間；bFGF組可見較多的毛細(xì)血管；G-CSF組也可見不少的毛細(xì)血管；對(duì)照組可見稀疏的毛細(xì)血管。bFGF+G-CSF組血管密度多于bFGF組(P=0.000)，也多于G-CSF組(P=0.000)；bFGF組側(cè)支血管數(shù)多于G-CSF組(P=0.002)；3個(gè)實(shí)驗(yàn)組側(cè)支血管數(shù)均多于

16、對(duì)照組(P<0.05)。 5 VEGF陽性表達(dá)的血管數(shù)VEGF抗體S-P二步法免疫組化法染色的切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色者為陽性細(xì)胞，該毛細(xì)血管即為VEGF陽性表達(dá)的血管。每一標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，在400倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)VEGF陽性表達(dá)的血管數(shù)，由兩人獨(dú)立分別計(jì)數(shù)染色之微血管數(shù)目，其平均值即為VEGF陽性表達(dá)的血管數(shù)。bFGF+G-CSF組均可見肌束間大量胞漿黃染的毛細(xì)血管；bFGF組可見較多胞漿

17、黃染的毛細(xì)血管；G-CSF組也可見不少胞漿黃染的毛細(xì)血管；對(duì)照組可見稀疏胞漿黃染的毛細(xì)血管。VEGF陽性表達(dá)的血管數(shù)依次為：bFGF+G-CSF組>bFGF組>G-CSF組>對(duì)照組(均為P<0.05)。結(jié)論1.在兔缺血后肢肌肉內(nèi)多次注射重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rh-bFGF)，方法簡單易行，安全可靠，可促進(jìn)血管新生，增加缺血后肢血液灌注，改善肢體缺血狀態(tài)； 2.單純皮下注射重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)可促使兔