TopBP1蛋白在細胞DNA損傷中的作用機制.pdf

1、為了保證細胞損傷后基因組的完整性，細胞通常會啟動檢測點機制以阻止細胞周期的進展。其中兩個PIKK激酶(phosphinositide 3-kinase-like kinase，磷酸肌醇3激酶樣激酶)起著中心的作用：ATM(ataxia telan-giectasia mutated，共濟失調(diào)及毛細血管擴張癥突變蛋白)與ATR(ATMand Rad3 related，ATM與Rad3相關(guān)蛋白)。ATM被認為負責放射損傷導致的檢查點阻滯的激

2、酶，而ATR則被認為負責復(fù)制受阻所致的基因組損傷。二者之間有互補性及簡并的功能。在ATR信號傳導途徑，ATR會激活并使許多下游的底物磷酸化，其中最主要的是Chkl激酶(Cheekpointkinase protein 1，檢測點激酶蛋白1)。Chkl一旦被激活會進一步作用于下游底物，其中主要為Cde25A。而Cdc25A會進一步調(diào)控Cdk與Cyelin復(fù)合物。迄今為止ATR-Chkl信號傳導途徑已是被公認的應(yīng)答途徑。 檢查點蛋白

3、通常被分類成如下幾類：探測蛋白，介導蛋白，近端信號傳導激酶，遠端信號傳導激酶，效應(yīng)蛋白。其中介導蛋白被認為提供場所或者在上游激酶或下游激酶進行信號傳遞的一組蛋白。由于對損傷應(yīng)答的不同，ATM與ATR的介導蛋白不同，其中Mdcl，53BPl(p53 binding pro-tein 1，p53結(jié)合蛋白1)與BRCAl主要聯(lián)系于ATM，而Claspin(目前無對應(yīng)中文翻譯)與TopBPl(TopoisomeraseⅡβ binding pr

4、otein 1，拓撲異構(gòu)酶Ⅱβ結(jié)合蛋白1)則被認為是ATR信號傳導途徑的介導蛋白。 TopBPl．是含有8個BRCT功能域(BRCAl C-terminus，BRCAl C端)1522個氨基酸的蛋白。首先被認為是DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱβ結(jié)合蛋白，在裂殖酵母及芽殖酵母中分別對應(yīng)為Rad4與Cut5，在細胞受到輻射后形成IRIF(Ionizing radiation induced loci，放射損傷導致的損傷灶)，此功能也依賴于其第5

5、個BRCT、功能域。此外，除了DNA損傷時信號的傳導，TopBPl還有其他的功能，是DNA復(fù)制啟動所必需的及當復(fù)制受阻時維持復(fù)制叉的完整性，DNA的修復(fù)，可以抑制E2F1．介導的凋亡及調(diào)節(jié)正常的S期細胞周期等等。Claspin是Chkl的結(jié)合蛋白。在人類及非洲爪蟾的基因序列非常保守，當細胞受到外界損傷后而這兩種蛋白質(zhì)形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物。在酵母這個復(fù)合物的形成依賴于人類ATR的類似物Mecl，進一步詳盡的研究表明，Claspin直接結(jié)

6、合在Chkl的激酶區(qū)。Claspin也同樣地與ATR直接結(jié)合，這樣就形成了一個模型：Claspin將Chkl集中到ATR周圍，而已經(jīng)磷酸化的Chkl則會擴散到整個細胞核，發(fā)揮其功能作用。 然而到目前為止，TopBPl與Claspin如何同時作用于Chkl的磷酸化，以致于導致其激活，及這兩種蛋白對ATR其他底物的作用，尚不清楚。本研究的目的是試圖研究這兩種蛋白在細胞受到損傷的作用是如何調(diào)節(jié)Chkl的活性的。同時通過克隆不同的T

7、opBPl變異蛋白，試圖研究TopBPI的BRCT功能域，及TopBPl蛋白在癌癥發(fā)生中的作用。 材料與方法 1．質(zhì)粒與克隆 (1)PCNA-Venus：PCR擴增編碼YFP-Venus的eDNA(由iapa-ner提供)然后將其克隆至pEGFP-C1(Clontech)中，并替代EGFP。然后再PCR擴增編碼PCNA的cDNA，將其按框架插入YFP-Venus之后。 (2)FLAG-tagged

8、 Chkl野生型及激酶滅活型，雙突變(serine317and 345被突變成alanine)(Chkl-2A)被克隆至pCI-Neo(由Sorensen提供)。 (3)shRNA-TopBPl-pSUPERIOR及shRNA-Claspin-pSUPE-RIOR：將分別針對TopBPI及Claspin的oligoes克隆至pSUPERIOR(OligoEngine)的BgllI/HindlII位點。針對TopBPl的oligo

9、為(5’-CCTGAAGAAACCTATTTTG-3’)，針對Claspin的oligo(5’-GCAATGAAACTCCGAAGGT-3’)。 2．抗體與siRNAs 兔多克隆抗體P-Chkl$317，P-Chkl$345，P-Nbsl$343，P-Smcl S966(從Cell Signaling購買)，TopBPI(Abcam)，Claspin(Bethyland Abcam)，Chkl(Santa Cruz)

10、and 53BPl(Santa Cruz)，山羊多克隆抗體Mcm6(Santa Cruz)．鼠單克隆抗體γ-H2AX(Upstate)，F(xiàn)LAG(clone M2，Sigma)，Chkl(DCS-316)，Cdk7(MO-7)，Mcm7(DCS-141)and the p32 subunit of RPA(Neomarkers)and大鼠單克隆抗體Br—dU(OBT0030CX—Immunologicals Direct)。 s

11、iRNA對TopBPl為AGACCUUAAUGUAUCAGUAdTdT siRNA對Claspin為GCACAUACAUGAUAAAGAA均從(Drama—con購買) 對照siRNA為針對HSP70B的序列，在U2OS細胞中這種基因缺失。 3．細胞培養(yǎng)與損傷處理 1)人成骨肉瘤U20S細胞(Danish Cancer Society)在含有10％小牛血清及青鏈霉素的Dulbeccos Modifi

12、ed Eagle Medium(DMEM，Invitro—gen)培養(yǎng)。對于活細胞成像，細胞用不含C0<,2>的培養(yǎng)液(Invitrogen)并且用Lab--Tek microscope glass chambers(Nalge Nunc International)。 2)siRNAs的轉(zhuǎn)染用oligofectamin(Invitrogen)，質(zhì)粒的穩(wěn)定及短暫轉(zhuǎn)染用FuGene 6(Roche Diagnostics GmbH

13、)，操作方法按照使用手冊。 A)Claspin及TopBPl inducible shRNA穩(wěn)定細胞系的建立：將shR—NA—TopBPl一pSUPERIOR或shRNA—Claspin—pSUPERIOR與PCDNA6 T/O(含有Tet--repressor)同時轉(zhuǎn)染到U20S細胞中，24小時后用puromycin(Sigma—lμg/ml)與blasticidin(InvivoGen一5μg/ml)篩選。兩周后挑選單個克隆

14、，擴增后，免疫印跡法驗證。用終濃度為2μg/ml doxycyclin(BD Biosciences)誘導shRNA的表達。 B)穩(wěn)定表達GFP--ATR的U20S細胞系(Jazayeri提供)。 C)細胞的放射損傷用X—Ray generator(Pantak HF160，150kV。15mA dose rate 2.18 Gy/min)。UV損傷用Stratalinker 1800(Strata—gene)。

15、 D)Hu(Sigma)加人使終濃度為2mM。 E)激光微照射(Laser micro--irradiation)：先將細胞培養(yǎng)于含有10μM BrdU 24小時，然后至于不含CO<,2>的培養(yǎng)液中，用337 nm UV—A laser照射大約200個細胞。 4．免疫化學技術(shù) 細胞用含有20 mM Tris，150mM NaCl，1mM EDTA與0.5％NP--40并加入抑制劑的溶液裂解。 免

16、疫沉淀法，首先將1—1.5mg裂解物用40μ150％的Gsepharoseslurry預(yù)先混合30分鐘，然后加入2ug的FLAG單克隆抗體，混合-小時；再離心去上清，用IP緩沖液洗4遍，用免疫印跡法分析免疫沉淀物。對于Chkl的印跡，我們用HRP—coupled Protein A來代替常規(guī)的第二抗體，以去除Chkl與IgG的重鏈區(qū)重疊的影響。 免疫熒光，將細胞培養(yǎng)在玻片上(Menzel)，用4％paraformaldehyde

17、室溫下固定15分鐘，然后用0.2％Triton X-100滲透化5分鐘。用指定的第一抗體染色-小時，用coupled tO Alexa dyes with excitation wave-lengths of 488，568或647 nm的第二抗體染色30分鐘(MolecularProbes)．在有特殊標記的部位用ToPrO3(Molecular Probes)復(fù)染，其他的用DAPI-containing mounting medium

18、復(fù)染(Vectashield)．圖像的取得用帶有PLAN-Neofluar 40x/1.3 oil immersion 04ective(Carl Zeiss)的LSM510共聚焦掃描顯微鏡(Carl Zeiss)。 免疫印跡：取對數(shù)期生長的細胞用含有酶抑制劑的IP緩沖液裂解，Bradford方法進行蛋白定量，之后與4*LSB緩沖液混合后100℃加熱5分鐘，加樣于6％-15％SDS-PAGE 100V電泳2小時，半干式轉(zhuǎn)印2小時

19、。然后先后孵育第一抗體及第二抗體(結(jié)合辣根過氧化物酶的馬抗鼠或兔IgG，Vector laboratories)，之后ECL顯色(SuperSignalWest Pico(Dura，F(xiàn)emto)Luminol Enhancer Solution與SuperSignalWest Pico(Dura，F(xiàn)em—to)Stable Peroxide Solution，PIERCE)與曝光。 5．流式細胞術(shù) 對指定時間的細胞消化后

20、用70％甲醇固定，之后用0.25％Triton X-100滲透化，之后用含有RNA酶的PI(0.1 mg/ml in PBS)37度染色10分鐘，用FACSCalibur flow cytometer(BD Biosciences)的CellQuestsoftware分析結(jié)果。 1．(1)RNA干擾使蛋白下調(diào)的模型的建立。我們成功地克隆了分別誘導下調(diào)TopBPl與Claspin的細胞系，經(jīng)過免疫印跡檢測TopBPlClaspin

21、的下調(diào)分別在Doxycyclin誘導后72小時及24小時達到最低點。而且通過流式細胞術(shù)的分析，在這兩個時間點上，兩種蛋白的下調(diào)并不干擾細胞周期的變化(圖1A及圖S1)。 (2)TopBPl或Claspin的下調(diào)使DNA損傷導致的Chkl激酶的磷酸化顯著受阻。給予這兩種細胞系予以UV-C(254nm，10J/m<'2>),照射損傷。因為UV-C使ATR-Chkl信號途徑激活。在兩個細胞系中，當兩種蛋白質(zhì)下調(diào)后，我們均觀察到了Ch

22、kl磷酸化信號的強烈衰減，而且我們觀察到TopBPl的下調(diào)導致更加明顯的效果(圖1B，C)。 (3)TopBPl與Claspin對DNA損傷導致的ATR介導的下游底物磷酸化的影響。在UV與Hu導致的DNA損傷中，在TopBPl下調(diào)的細胞，所有的ATR底物磷酸化均受阻，而在Claspin下調(diào)的細胞，僅Chkl磷酸化受阻(圖2A)。另外，在IR介導的DNA損傷中，在兩種蛋白分別下調(diào)的細胞中，僅Chkl的磷酸化受阻。進一步在進行兩種蛋白

23、雙重下調(diào)的實驗中，Chkl的磷酸化下調(diào)水平并不是隨著Claspin的下調(diào)而進一步下降(圖2B及圖S2)。 (4)TopBPl與Claspin的空間分布特點。在DNA損傷后，TopBPl與ATR緊密地在損傷處形成小的foci(圖3B)；而Claspin則是同Chkl類似，迅速地擴展到全細胞核，并不在損傷處聚集(圖3A)。又及TopBPl的下調(diào)對ATR在損傷處的聚集無影響(圖3D)。 (5)Claspin而不是TopBP

24、l的下調(diào)導致了與Chkl受抑類似的表現(xiàn)型，即在Claspin下調(diào)后，H2AX的磷酸化在S期細胞升高，而在TopBPI的下調(diào)的細胞則無類似的發(fā)現(xiàn)(圖4A，B)。 (6)TopBPl而不是Claspin是對復(fù)制受阻導致的H2AX磷酸化的主要因素。給予下調(diào)TopBPl的細胞UV照射，并用免疫印跡法研究磷酸化的H2AX的表達。與對照細胞相比，H2AX的磷酸化在TopBPl下調(diào)的細胞顯著受阻(圖5A)。 (7)在DNA損傷Cla

25、spin與Chkl的結(jié)合依賴于TopBPl。首先通過短暫轉(zhuǎn)染Flag標記的Chkl到U2OS細胞中，證實了Claspin與Chkl僅僅在UV損傷后結(jié)合，在給予ATR的抑制劑咖啡因后，特別地抑制了這種結(jié)合(圖6A)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，兩個重要的Chkl磷酸化位點s317與s345對二者之間的結(jié)合并無影響。在幾次實驗中，均發(fā)現(xiàn)了激酶滅活型的Chkl在與Claspin結(jié)合的有不同程度的減低。或者在給予UCN-O1的處理后也有類似的發(fā)現(xiàn)(圖6B

26、)。為了證實這是否依賴于TopBPl，給予誘導下調(diào)TopBPl的細胞轉(zhuǎn)染以Flag-Chkl，轉(zhuǎn)染24小時后給予UV 25J/m<'2>。免疫印跡結(jié)果顯示在TopBPl下調(diào)的細胞中Claspin與Chkl的結(jié)合顯著降低(圖6C)。這些結(jié)果表明，TopBPl不僅直接作用于Chkl的s317與s345的磷酸化，也對Claspin與Chkl的結(jié)合起著重要的作用。 2．克隆了兩個新的質(zhì)粒：AcGFP-C1-TopBPl(shRNA-in

27、sensi-tive)及AcGFP-C1-TopBPl(shRNA-insensitive and R309C)。 3．克隆了FLAG，標記的含有完整TopBPl cDNA及包含不同BRCT、功能域的TopBPl片段及上述質(zhì)粒的W1145R，DDll46(7)AA，EEll52 (3)AA的突變序列。 檢測點是維持基因組完整性非常重要的機制之一，ATR—Chkl信號傳導通路在細胞受到UV或Hu損傷所致的復(fù)制叉受阻

28、所發(fā)生的細胞信號活動起著至關(guān)重要的作用。 有報告表明，ATR對Chkl的激酶活化需要Claspin的參與，在裂殖酵母中Rad4<'TOpBP1>是Rad3<'ATR>的調(diào)控蛋白。根據(jù)這些資料，我們提出一些問題，1．在人類細胞中TopBPl是否為ATR的調(diào)控蛋白。2．如果TopBPI與Claspin都是激活Chkl所必需的，那么二者之間的關(guān)系是如何的。3．Claspin蛋白對ATR的其他底物磷酸化是怎樣的?4．TopBPl是否對A

29、TR在損傷處的聚集有影響?我們通過一系列實驗逐一驗證并試圖回答了這些問題，并且首次提出了一個TopBPl與Claspin如何監(jiān)控ATR—Chkl維持基因組完整性的模型，在這個模型中，TopBPl調(diào)節(jié)幾乎所有的ATR對下游底物的激活，而Claspin則專一性地將ATR與Chkl聯(lián)系在一起。這個模型與最近發(fā)表的TopBPl對ATR介導的Radl與Husl磷酸化是必需的一致。進一步地證實了TopBPl作用于Claspin介導Chkl磷酸化的上

30、游。因為我們還發(fā)現(xiàn)Chkl磷酸化受阻在TopBPl下調(diào)的細胞較Claspin下調(diào)的細胞更加明顯。另外在TopBPl下調(diào)細胞中Chkl的活性受抑已達到最大化，而且進一步下調(diào)Claspin對其已不再起作用。更進一步證實了TopBPl對損傷后形成的Claspin-Chkl復(fù)合物是必需的。Dunphy等人在剛剛發(fā)表的報告中指出了在體外與體內(nèi)TopBPl均與ATR相結(jié)合以及TopBPl是ATR的全激動劑。我們的報告也支持了這個結(jié)論。

31、 Chkl與ATR的其他底物顯著不同，這是由于Chkl激酶有著極為重要的功能，Chkl的敲除會導至胚胎死亡，Chkl的下調(diào)或其激酶活性受到抑制會使細胞在G2M期阻滯。因此這兩種蛋白對Chk1激酶活性的雙重調(diào)節(jié)可以使其生理活性得到更為精確地發(fā)揮。 除此之外，我們還第一次證實了Claspin與Chk1一樣，在基因組受到損傷后呈現(xiàn)出全細胞核內(nèi)分布的特點。而TopBP1則和ATR一樣，在損傷處聚集。TopBP1的下調(diào)對ATR在損傷處的聚

32、集沒有影響。結(jié)合已發(fā)表的資料，我們有如下猜想：RPA與ATRIP負責ATR在損傷處的聚集而TopBP1則負責對ATR的激活，ATR將信號傳導至Claspin再到Chk1。然而就這個模型而言還有許多不清楚的地方。例如，RPA是不是TopBP1蛋白在損傷處聚集的決定因素，如果不是，那么是什么蛋白決定TopBP1在損傷處的聚集；我們的結(jié)論表明TopBP1可以促進Claspin與Chk1的結(jié)合，已知ATR可以同Chk1結(jié)合，Claspin與AT

33、R在有無DNA損傷的情況下相結(jié)合，并且按照我們的上述結(jié)果，ATR與TopBP1呈現(xiàn)相對靜止，Claspin與Chk1呈現(xiàn)相對動態(tài)的變化，它們在正常的細胞是如何達到一個平衡，在細胞受損時怎樣，在損傷得到修復(fù)時又會發(fā)生怎樣的變化。又及這些蛋白都有磷酸化形態(tài)，特別是Chkl的s345與s317是非常重要的磷酸化位點，這些蛋白的磷酸化形態(tài)與正常蛋白之間是如何達到平衡的。 TopBPl是否是一個抑癌基因也是十分有趣的課題。目前僅有一份未發(fā)

34、表的報告，TopBP1的R309C突變在癌癥病人中有較高的發(fā)生率，又及TopBP1與BRCA1在序列及功能上有很多相似性，而BRCAl是已知的抑癌基因，我們推測TopBP1也具有抑癌基因的特征。因此我們設(shè)計了簡單的實驗檢測TopBP1的R309C突變對其功能的影響。 BRCT、家族有很多蛋白質(zhì)組成，BRCT也是非常重要的功能域，TopBP1作為唯一的僅擁有BRCT功能域的蛋白是研究BRCT功能的很好的對象。我們想知道的是在Top

35、BP1蛋白上，不同的BRCT功能域作用是否相同，以及它們是否協(xié)同作用，以及在BRCT功能域之間的連接部分是否也有一定的功能等等。 總之，TopBP1作為ATR的調(diào)節(jié)蛋白，而TopBP1與Claspin作為不同層面起著調(diào)節(jié)ATR活性的作用，因此在ATR—Chk1調(diào)節(jié)通路起著極為重要的作用。其作用機理細節(jié)還需要進一步的研究。 結(jié)論 1．TopBPl是ATR激酶的全激動劑，而Claspin僅作用于ATR對Chkl的激活

36、。TopBP1對ATR在損傷處的聚集沒有影響。這一點與A－TRIP和RPA對ATR的影響是不同的。 2．TopBP1和Claspin對Chk1激酶有著雙重調(diào)節(jié)作用。 3．TopBP1能促進DNA損傷后Claspin與Chkl的結(jié)合。 4．TopBP1與ATR是相對靜止性的蛋白，而Claspin與Chkl是相對動態(tài)性的蛋白，說明了二者對Chkl的不同層面的調(diào)節(jié)作用。 5．克隆了兩個新的質(zhì)粒：AcGFP－C1