熱休克蛋白70在苯并（a）芘致細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用.pdf

1、本研究采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和槲皮素處理的方法，分別使肺腺癌細(xì)胞A549的Hsp70過表達(dá)或抑制，建立Hsp70過表達(dá)細(xì)胞株與Hsp70抑制細(xì)胞模型。采用單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳(singlecellagarosegelelectrophoresis，SCGE)、Western-blot等方法，觀察在BaP作用下，未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞DNA損傷和Hsp70表達(dá)的關(guān)系。并用單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳方法觀察在BaP作用下Hsp70過表達(dá)和抑制細(xì)胞DNA損傷作用

2、的變化，研究Hsp70在DNA損傷中的保護(hù)作用。用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，研究Hsp70在BaP致細(xì)胞主要核苷酸切除修復(fù)酶mRNA表達(dá)變化中的作用。探討Hsp70在BaP所致細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中的作用，為防治環(huán)境危害因素BaP對機(jī)體的危害作用提供科學(xué)依據(jù)。本研究共分三部分。 第一部分：Hsp70過表達(dá)與Hsp70抑制細(xì)胞模型的建立 本部分首先采用含hsp70基因cDNA的pcDNA3.0/hsp70重組質(zhì)粒對A54

3、9細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，建立穩(wěn)定過量表達(dá)Hsp70的細(xì)胞株。以空載體質(zhì)粒pcDNA3.0轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞作載體對照。用G418篩選細(xì)胞，并對3個(gè)含hsp70基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞克隆進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色分析。挑選Hsp70表達(dá)熒光強(qiáng)度最高的細(xì)胞克隆，與未轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和空載體質(zhì)粒pcDNA3.0轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞一起，采用Western-blot對其Hsp70表達(dá)水平進(jìn)行分析。 為了建立Hsp70抑制的細(xì)胞模型，本研究采用槲皮

4、素處理A549細(xì)胞。槲皮素(quercetin)是一種廣泛存在的生物黃酮類物質(zhì)，有較強(qiáng)的抗氧化能力，可以抑制某些腫瘤細(xì)胞Hsp70的合成，使細(xì)胞Hsp70表達(dá)降低。本研究用50、100、150、200μmol/L槲皮素處理A549細(xì)胞，37℃培養(yǎng)6h后，用MTT實(shí)驗(yàn)和Western-blot方法分別檢測A549細(xì)胞活性和Hsp70表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨槲皮素濃度的增加，A549細(xì)胞的細(xì)胞活性呈下降趨勢，并呈現(xiàn)一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。隨著槲

5、皮素濃度的加大，Hsp70表達(dá)逐漸受到抑制。當(dāng)槲皮素濃度達(dá)到100、150和200μmol/L時(shí)，Hsp70表達(dá)顯著降低。綜合考慮槲皮素對A549細(xì)胞活性及Hsp70表達(dá)水平的影響，本研究用150μmol/L槲皮素處理A549細(xì)胞6h抑制Hsp70的表達(dá)作為Hsp70降低的細(xì)胞模型。 第二部分：Hsp70在苯并(a)芘致細(xì)胞DNA損傷中的保護(hù)作用 為了研究在BaP作用下，Hsp70在DNA損傷中的作用，本研究首先將未轉(zhuǎn)染

6、A549細(xì)胞暴露于不同濃度的BaP中，觀察DNA損傷與Hsp70表達(dá)之間的關(guān)系。 為進(jìn)一步研究Hsp70在BaP致A549細(xì)胞DNA損傷中的保護(hù)作用，本研究采用第一部分建立的Hsp70過表達(dá)和抑制細(xì)胞模型，將不同Hsp70表達(dá)的細(xì)胞暴露于不同濃度的BaP，用MTT和單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)等方法，直接觀察Hsp70在BaP致DNA損傷中的保護(hù)作用。 第三部分：Hsp70在苯并(a)芘致細(xì)胞主要核苷酸切除修復(fù)酶mRNA水平

7、變化中的作用以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hsp70對苯并(a)芘所致DNA損傷具有一定的保護(hù)作用，在BaP作用下Hsp70過表達(dá)細(xì)胞A549/Hsp70細(xì)胞活性明顯高于A549細(xì)胞，DNA損傷程度明顯低于A549細(xì)胞。但對于Hsp70如何發(fā)揮保護(hù)DNA損傷作用的機(jī)制仍不清楚。 BaP作用產(chǎn)生的損傷，主要是由核苷酸切除修復(fù)途徑來完成。Hsp70在苯并(a)芘致細(xì)胞主要核苷酸切除修復(fù)酶mRNA表達(dá)變化中是否具有一定作用呢?本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定

8、量RT-PCR方法，檢測BaP作用下，A549、Hsp70過表達(dá)細(xì)胞A549/hsp70和槲皮抑制Hsp70細(xì)胞A549/Quercetin主要核苷酸切除修復(fù)酶mRNA的變化，探討Hsp70在苯并(a)芘致細(xì)胞主要核苷酸切除修復(fù)酶mRNA水平變化中的作用。 綜上所述，本研究結(jié)果表明： (1)采用含hsp70基因cDNA的pcDNA3.0/hsp70重組質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及用150μmol/L槲皮素處理A549細(xì)胞6

9、h抑制Hsp70的表達(dá)，可以分別建立Hsp70過表達(dá)和Hsp70抑制的細(xì)胞模型。 (2)一定劑量的BaP作用24h，它的代謝產(chǎn)物可能通過一定程度抑制A549細(xì)胞的Hsp70表達(dá)而導(dǎo)致DNA損傷，Hsp70表達(dá)水平與DNA損傷程度呈負(fù)相關(guān)。 (3)在BaP作用下，與未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞相比，Hsp70過表達(dá)細(xì)胞A549/hsp70細(xì)胞活性明顯提高，DNA損傷程度顯著性降低；而槲皮素處理細(xì)胞A549/QuercetinDNA

10、損傷程度呈顯著性升高。這表明升高Hsp70水平有助于增強(qiáng)細(xì)胞對BaP危害作用的耐受能力，對BaP所致細(xì)胞DNA損傷有明顯的保護(hù)作用。 (4)Hsp70可能在BaP致核苷酸切除修復(fù)酶XPC、XPBmRNA水平變化中具有一定作用。 盡管本研究已得到一些初步結(jié)果，但如下幾個(gè)方面的問題尚有待于進(jìn)一步深入研究： 1、運(yùn)用siRNA技術(shù)，特異性抑制Hsp70的表達(dá)，深入研究Hsp70在DNA與修復(fù)中的作用機(jī)理。2、對于Hsp