KLF4在電離輻射致星形膠質(zhì)細胞DNA損傷中的作用機制研究.pdf

1、目的：人類顱腦及頭面部腫瘤在進行放射治療的同時難免會造成正常大腦組織及面部器官的輻射損傷。星形膠質(zhì)細胞是大腦組織的最主要組成部分，本實驗的目的在于研究Krüppel-like factor4(KLF4)在電離輻射致星形膠質(zhì)細胞DNA損傷及其修復(fù)中所起的作用及其相應(yīng)的機制，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的放射治療及輻射防護提供新的思路和方法。
　　 KLF4在人體內(nèi)是一個在多種組織中廣泛表達的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，作為KLF因子家族的一員，KLF

2、4在細胞分化和細胞周期調(diào)節(jié)中扮演非常重要的角色。根據(jù)靶基因的不同，KLF4既可以激活又可以抑制轉(zhuǎn)錄作用。目前已知的KLF4在細胞損傷中的作用為： DNA損傷激活抑癌基因p53，繼而激活KLF4，KLF4通過激活或抑制下游基因如p21的表達顯示出如調(diào)節(jié)G1/S期和G2/M期周期過渡等多重效應(yīng)。此外，在特定的細胞微環(huán)境情況下，KLF4既可以作為腫瘤抑制因子也可以作為癌基因。
　　 ShuheiMatsuoka等人的工作表明，很多蛋白

3、在DNA受到損傷后既參與周期阻滯又逆向參與DNA損傷及其重組修復(fù)，那么在中樞神經(jīng)系統(tǒng)輻射損傷中KLF4既能調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞G1/S期和G2/M期周期過渡，它有沒有逆向參與星形膠質(zhì)細胞DNA損傷或其修復(fù)的功能呢？也就是說KLF4在星形膠質(zhì)細胞DNA損傷中扮演的角色究竟是損傷還是損傷修復(fù)？KLF4作為具有正性和負性轉(zhuǎn)錄作用的轉(zhuǎn)錄因子，在星形膠質(zhì)細胞受到外界包括電離輻射等各種損傷因素惡變?yōu)樾切渭毎鰰r，或在星形膠質(zhì)瘤進行放療時，其所處正常星形

4、膠質(zhì)細胞和星形細胞瘤微環(huán)境的不同，KLF4在其中充當何種角色，它在星形膠質(zhì)細胞DNA損傷修復(fù)過程中是作為轉(zhuǎn)錄激活因子還是轉(zhuǎn)錄抑制因子及其相應(yīng)的分子機制尚不夠清楚。我們對于KLF4因子不同功能間的轉(zhuǎn)換，在正常星形膠質(zhì)細胞的放射損傷中的作用及其相應(yīng)的分子機制研究，將進一步為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生機制和放射治療的研究提供新的策略思路。
　　 方法：1我們利用小鼠大腦組織各種細胞貼壁能力的不同采用差速貼壁及振蕩法原代培養(yǎng)昆明種新生小鼠大

5、腦組織的星形膠質(zhì)細胞并將其純化，采用流式細胞儀鑒定星形膠質(zhì)細胞的純度。
　　 2給予星形膠質(zhì)細胞4Gy X射線照射前后采用RT-PCR等方法測定其KLF4在照射前后不同時間點的表達并比較其差異，采用免疫熒光法測定其與γ-H2AX這一DNA損傷標志蛋白的表達的共定位程度。
　　 3使用慢病毒導(dǎo)入星形膠質(zhì)細胞干擾其KLF4后，再給予相同劑量的電離輻射后，采用RT-PCR測定其KLF4 mRNA在照射前后不同時間點的表達并比較

6、其差異，采用彗星實驗(comet)檢測星形膠質(zhì)細胞DNA損傷的程度在干擾前后的差異。
　　 4運用Western-blot方法，對比經(jīng)慢病毒干擾KLF-4后的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)過4GY電離輻射后與對照組之間，細胞對DNA損傷的兩種主要修復(fù)方式（以DNA依賴蛋白激酶為主的非同源性末端連接修復(fù)和以ATM為主的同源重組）的主要基因即DNA損傷修復(fù)及腫瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs，其蛋白質(zhì)印跡的差異。
　　 5在以上工作的基礎(chǔ)

7、上，我們做了初步的關(guān)于KLF4在腦膠質(zhì)瘤中的表達的預(yù)實驗，為下一步工作即KLF4在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制中的作用做準備。我們收集了10例正常大腦、4例Ⅱ期腦膠質(zhì)瘤、8例Ⅲ期腦膠質(zhì)瘤、10例Ⅳ期腦膠質(zhì)瘤cDNA，比較了其KLF4 mRNA表達。
　　 結(jié)果：1.采用分離純化原代培養(yǎng)昆明種小鼠的大腦星形膠質(zhì)細胞，選擇GFAP作為細胞鑒定的表面標記抗原，獲得的星形膠質(zhì)細胞純度達90％以上，且細胞數(shù)量滿足實驗需要。
　　 2.給予昆

8、明種小鼠原代星形膠質(zhì)細胞4Gy X射線照射后，通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)KLF4的表達與γ-H2AX的表達不僅在核中有90％的共定位，而且隨時間的延長，表達強度變化趨勢一致。
　　 3.原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)慢病毒干擾KLF4基因后，經(jīng)過4 GyX射線照射后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)其γ-H2AX的mRNA值降低，采用中性彗星實驗(neutralcomet)尾矩顯著減小而堿性彗星實驗(alkaline comet)尾距顯著增長。

9、　　 4.運用Western-blot方法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)慢病毒干擾KLF-4后的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)過4GY電離輻射后與對照組相比，細胞對DNA損傷的兩種主要修復(fù)方式（以DNA依賴蛋白激酶為主的非同源性末端連接修復(fù)和以ATM為主的同源重組）的主要基因即DNA損傷修復(fù)及腫瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs，其蛋白質(zhì)印跡均明顯增強。此結(jié)果證實：Klf4抑制了電離輻射引起的DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)，是通過抑制細胞對DNA損傷的兩種主要修復(fù)方式的主要基因即

10、DNA損傷修復(fù)及腫瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs來實現(xiàn)的，干擾KLF-4后，星形膠質(zhì)細胞經(jīng)電離輻射后DNA損傷的兩種修復(fù)方式的主要作用基因ATM和DNA-PKCs的損傷修復(fù)及腫瘤抑制作用將明顯加強。
　　 5.比較了正常大腦及各期腦膠質(zhì)瘤Klf4 mRNA表達，結(jié)果顯示KLF4隨腦膠質(zhì)瘤惡性程度的增加表達也增加，呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：我們的實驗結(jié)果表明KLF4這一基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)輻射損傷及修復(fù)中對星形膠質(zhì)細胞

11、DNA雙鏈斷裂的作用為損傷作用，而對星形膠質(zhì)細胞DNA單鏈斷裂的作用為損傷修復(fù)作用，與已報道的其對纖維原細胞的作用不同，表明KLF4在不同細胞環(huán)境中以及在不同的DNA損傷類型及其修復(fù)中扮演了不同的角色。實驗還證實了KLF4抑制電離輻射引起的DNA雙鏈斷裂損傷的修復(fù)，是通過抑制細胞對DNA損傷的兩種主要修復(fù)方式的主要基因即DNA損傷修復(fù)及腫瘤抑制基因ATM和DNA-PKCs來實現(xiàn)的。此外，KLF4與腦膠質(zhì)瘤惡性程度有一定關(guān)聯(lián)，呈正相關(guān)，為