KLF4在TGF-β1誘導血管平滑肌細胞分化中的作用及機制研究.pdf

1、為了闡明KLF4在TGF-β誘導VSMC分化中的作用及其分子機制，本文在系統(tǒng)研究TGF-β1對VSMC增殖、分化、遷移、細胞周期等生物學行為影響的基礎上，進一步探討KLF4在TGF-β1促進VSMC分化中的作用和分子機制。旨在為揭示動脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄等心血管疾病的發(fā)病機制提供新的實驗和理論依據(jù)，為心血管疾病的防治提供新的靶點。
　　 1.TGF-β1誘導VSMC分化與上調(diào)KLF4和TβRI表達有關本部分實驗以VSM

2、C分化和去分化標志基因表達水平作為判斷VSMC表型的指標，檢測TGF-β1對VSMC表型及相關生物學行為的影響。為了考察TβRI是否參與TGF-β1誘導VSMC分化的過程，一方面，觀察敲減TβRI基因表達對VSMC分化和去分化標志基因表達的影響；另一方面，觀察KLF4過表達和敲減對TβRI表達以及對VSMC分化和去分化標志基因表達的影響。實驗結果如下：
　　 1.1TGF-β1抑制VSMC增殖、遷移和細胞周期進程MTT分析、細胞

3、計數(shù)、傷口愈合實驗結果顯示，TGF-β1能以濃度（0.5、1、2、4ng/ml）和時間（24、48h）依賴的方式抑制VSMC增殖和遷移，以TGF-β1濃度為2ng/ml作用于VSMC48h對細胞增殖和遷移的抑制作用最強。
　　 流式細胞術檢測結果顯示，TGF-β1能以時間（6、12、24、48h）依賴的方式抑制VSMC細胞周期的進程。TGF-β1（2ng/ml）刺激VSMC48h后，停滯于G0/G1期的細胞數(shù)顯著增加，同時處于S

4、期和G2/M期的細胞數(shù)明顯減少。
　　 1.2TGF-β1誘導VSMC分化標志基因SM22α和SMα-actin表達SM22α和SMα-actin表達是VSMC處于分化狀態(tài)的重要分子標志，PCNA表達是VSMC處于增殖狀態(tài)的重要標志。
　　 1.3敲減TβRI表達對VSMC分化和去分化標志基因表達的影響
　　 1.4KLF4在TGF-β1誘導TβRI表達及VSMC分化中的作用雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KLF4是參與細胞生長、分

5、化和凋亡的調(diào)控，但KLF4是否通過TβRI介導TGF-β1的作用目前尚不清楚。
　　 2.TGF-β1通過激活Smad和p38MAPK信號通路誘導KLF4磷酸化和KLF4與Smad2/3相互作用TGF-β1通過與VSMC上的相應受體相互作用而觸發(fā)細胞信號的跨膜轉(zhuǎn)導，進而活化Smad信號通路而激活相關基因表達。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）級聯(lián)反應是胞內(nèi)信號進行交互作用

6、的重要信號轉(zhuǎn)導通路。在上述闡明KLF4通過TβRI介導TGF-β誘導VSMC分化的基礎上，本部分實驗探討TGF-β1對Smad和MAPK信號途徑的影響，以期闡明TGF-β1誘導KLF4活化和促進細胞分化的信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 2.1TGF-β1通過激活Smad和p38MAPK信號途徑誘導KLF4磷酸化VSMC經(jīng)TGF-β1（2ng/ml）刺激5、10、20、40min，用磷酸化絲氨酸抗體對細胞裂解液進行免疫沉淀后檢測磷酸化KLF

7、4的水平。
　　 2.2TGF-β1通過誘導KLF4磷酸化而促進KLF4與Smad2/3相互作用免疫共沉淀分析結果顯示，VSMC被TGF-β1處理后，KLF4與Smad2/3相互作用形成的復合物明顯增加。VSMC在TGF-β1（2ng/ml）刺激5、10、20、40min后，隨著刺激時間的延長，KLF4與Smad2/3的結合明顯增加，交互免疫沉淀也得到相似的結果。表明，TGF-β1能顯著促進KLF4與Smad2/3的相互作用，并

8、具有明顯的時效關系。
　　 2.3KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI基因表達上述實驗證實，TGF-β1促進KLF4與Smad2/3相互作用。為了檢查KLF4與Smad2/3相互作用在調(diào)節(jié)TβRI表達中的意義，我們首先進行了報告基因分析。將TβRI啟動子指導的報告基因分別與KLF4或Smad2表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細胞時，KLF4和Smad2均能促進TβRI啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。KLF4和Smad2共轉(zhuǎn)染使TβRI啟動子活性比轉(zhuǎn)染其

9、中一種表達質(zhì)粒升高1倍左右。表明KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI基因表達。
　　 3.KLF4與Smad2協(xié)同激活TβRI啟動子的作用機制對TβRI基因啟動子區(qū)域的核苷酸序列進行計算機分析的結果表明，TβRI啟動子區(qū)存在KLF4（CACCC）和Smad（CAGAC）結合位點。本部分實驗研究KLF4和Smad2與其結合位點的相互作用，進一步揭示KLF4和Smad2對TβRI基因表達的調(diào)控方式。
　　 3.1KLF4直接

10、結合于TβRI啟動子區(qū)的CACCC元件上并激活TβRI基因轉(zhuǎn)錄TβRI啟動子指導的報告基因分析結果顯示，KLF4以劑量依賴的方式增強TβRI啟動子的活性。染色質(zhì)免疫沉淀實驗（CHIP）結果顯示，內(nèi)源性和外源性的KLF4均可結合到TβRI啟動子上。缺失TβRI啟動子區(qū)的KLF4結合位點及突變KLF4結合位點后進行報告基因分析的結果表明，KLF4通過與TβRI啟動子近端的兩個KLF4結合位點：即KLF4結合位點2（-402～-398，CAC

11、CC）和位點3（-343～-339，CACCC）相互作用而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。Oligopull-down分析結果進一步證實，KLF4直接結合于TβRI啟動子區(qū)的KLF4結合位點2和3上。
　　 3.2Smad2在TGF-β1誘導TβRI表達中的作用Smad是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要成員。上述研究結果表明，KLF4可直接激活TβRI基因的表達，但與KLF4相互作用的Smad2和Smad3是否影響TβRI基因的表達，目前尚不

12、清楚。
　　 本部分實驗將靶向Smad2或Smad3的siRNA導入VSMC，阻斷內(nèi)源性Smad2或Smad3的表達后，檢查Smad2或Smad3在TGF-β1誘導TβRI表達中的作用。Westernblot分析結果顯示，轉(zhuǎn)染Smad2或Smad3的siRNA在敲低Smad2或Smad3表達的同時，也顯著降低TβRI基因的表達。以Smad2表達載體pcDNA3.0-Smad2轉(zhuǎn)染VSMC，證實Smad2在VSMC中的過表達能顯著

13、上調(diào)TβRI的表達。這些結果提示，Smad2和Smad3與TβRI的表達呈正相關。
　　 3.3Smad2通過與TβRI啟動子區(qū)的Smad結合元件相互作用而激活基因表達TβRI啟動子指導的報告基因分析結果表明，Smad2也能以劑量依賴性方式增強TβRI啟動子的活性。ChIP分析結果顯示，在用Smad2抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中可以擴增得到TβRI基因啟動子區(qū)的Smad（-806～-561）結合區(qū)域，TGF-β1處理使Smad

14、2與DNA的結合顯著增加。
　　 為了定位TβRI啟動子區(qū)的Smad2結合元件，進一步對截短的TβRI啟動子進行報告基因分析。結果表明，Smad2只能激活含TβRI轉(zhuǎn)錄起始點上游-993bp的TβRI啟動子，不能激活截短的、缺失-806～-561核苷酸序列的TβRI啟動子。結果提示，Smad結合元件位于TβRI啟動子區(qū)的-806～-561區(qū)域。
　　 3.4KLF4與預先結合在Smad結合位點上的Smad2協(xié)同激活TβR

15、I基因轉(zhuǎn)錄交互ChIP實驗結果顯示，在用KLF4抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中既能擴增得到TβRI基因啟動子區(qū)的KLF4結合序列（-483～-241），又能擴增得到Smad結合序列（-806～-561），而在Smad2抗體沉淀的VSMC染色質(zhì)片段中，只能擴增到TβRI基因啟動子區(qū)的Smad結合序列，不能擴增得到KLF4的結合序列。這些結果表明，KLF4-Smad2復合物位于Smad結合區(qū)。連續(xù)ChIP分析進一步顯示，在用Smad2抗體再

16、次沉淀KLF4抗體沉淀得到的染色質(zhì)片段時，二次沉淀物中仍能擴增得到Smad結合序列。以上結果再次表明，KLF4與Smad2在TβRI基因啟動子的Smad結合區(qū)形成復合物。
　　 為了進一步證實在Smad結合區(qū)形成的KLF4-Smad2復合物能協(xié)同激活TβRI基因的轉(zhuǎn)錄，對缺失KLF4或Smad2結合位點的TβRI啟動子進行報告基因分析。結果表明，缺失Smad結合區(qū)域（-806～-561）后，Smad2的轉(zhuǎn)錄激活作用以及Smad2

17、和KLF4的協(xié)同激活作用消失。用Smad2-siRNA靶向敲低Smad2表達后進行報告基因分析的結果表明，敲低Smad2的表達也消弱了KLF4的轉(zhuǎn)錄激活作用，說明KLF4的激活作用部分依賴于與Smad結合區(qū)結合的Smad2。以上結果表明，KLF4與Smad2在Smad結合區(qū)形成復合物協(xié)同激活TβRI基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 結論
　　 1.TGF-β1通過KLF4介導的TβRI表達抑制血管平滑肌細胞周期的進程并促進分化。

18、>　　 2.TGF-β1通過激活Smad和p38MAPK信號途徑誘導KLF4的磷酸化，磷酸化型KLF4與Smad2/3的相互作用增強。
　　 3.KLF4直接結合于TβRI啟動子區(qū)KLF4結合位點2（-402～-398，CACCC）和結合位點3（-343～-339，CACCC）并轉(zhuǎn)錄激活TβRI基因的表達，Smad2通過與Smad結合元件相互作用激活TβRI基因的表達。
　　 4.KLF4與預先結合在Smad結合元件上