KLF4調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ1型受體表達及血管平滑肌細胞增殖的分子機制研究.pdf

1、目的：血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)異常增殖是血管增殖性疾病，如動脈粥樣硬化、血管再狹窄、高血壓等發(fā)生發(fā)展的基本細胞病理學(xué)基礎(chǔ)。鋅指轉(zhuǎn)錄因子Krüppel-like factor 4(KLF4)是一種多能轉(zhuǎn)錄因子。KLF4不僅調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和炎癥基因表達，而且也是將體細胞重編程為類多能干細胞(iPS)必不可少的4種轉(zhuǎn)錄因子之一。近年大量研究表明，在VSMC中，KLF4不僅調(diào)節(jié)VSM

2、C標(biāo)志基因及細胞周期調(diào)節(jié)基因的表達，而且還與多種MicroRNA(miRNA)相互調(diào)節(jié)，在VSMC表型轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要的作用。KLF4可被多種細胞因子激活，如轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)，全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)和血小板源性生長因子BB(platelet-derived growth factor BB，PDGF-BB)。我

3、室最近的研究表明，TGF-β1通過Smad和p38信號途徑誘導(dǎo)KLF4磷酸化，磷酸化型KLF4與Smad2/3相互作用協(xié)同激活TGF-β Ⅰ型受體(TGF-β type Ⅰ receptor，TβRI)的表達，進而抑制VSMC的周期進程并促進分化。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，ATRA通過激活JNK和p38信號通路誘導(dǎo)KLF4磷酸化以及KLF4與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300的相互作用，進而激活VSMC標(biāo)志基因平滑肌22 alpha(smooth mus

4、cle 22 alpha，SM22α)表達；PDGF-BB通過激活ERK和PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)KLF4脫磷酸化以及KLF4與組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶HDAC2的相互作用，進而阻抑SM22α表達。因此，影響VSMC表型的環(huán)境因子刺激VSMC增殖和誘導(dǎo)VSMC分化都需要KLF4參與，KLF4發(fā)揮哪種作用取決于與它相互作用的輔助因子以及它的修飾狀態(tài)。進一步研究促增殖和促分化信號對KLF4修飾狀態(tài)及其與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的影響，深入探究K

5、LF4在VSMC表型轉(zhuǎn)化中的作用及機制，對防治血管重塑性疾病具有重要意義。
　　血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)中主要的生物活性肽。Ang Ⅱ能促進VSMC增殖，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。Ang Ⅱ絕大多數(shù)已知的生理及病理生理學(xué)效應(yīng)是通過其作用于Ang Ⅱ 1型受體(Ang Ⅱtype 1 receptor，AT1

6、R)來實現(xiàn)的。因此，AT1R表達量的多少在一定程度上決定了Ang Ⅱ的生物學(xué)效應(yīng)，研究AT1R基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有十分重要的意義。多種細胞因子可影響AT1R的表達，如胰島素樣生長因子(insulin-likegrowth factor)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)和維甲酸(retinoic acid)等。Meijering等的研究表明，在VSMC中，TGF-β1抑制AT1R基因的轉(zhuǎn)錄，但對于其確

7、切的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不清楚。通過對AT1R基因啟動子區(qū)-1423/+33這段序列的分析，我們發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域包含4個KLF4結(jié)合元件，推測KLF4可能是參與AT1R基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子。為此，我們對TGF-β1-KLF4通路在AT1R基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及VSMC增殖中的作用進行了深入的研究。
　　方法：細胞培養(yǎng)，腺病毒表達載體及質(zhì)粒載體的構(gòu)建，定點突變分析，小干擾RNA轉(zhuǎn)染，RNA提取及實時定量PCR分析，Western印跡分析，熒光素

8、酶報告基因分析，染色質(zhì)免疫共沉淀分析，寡核苷酸pull-down分析，免疫共沉淀分析，BrdU摻入分析等。
　　結(jié)果：
　　1.KLF4介導(dǎo)TGF-β1對AT1R表達的抑制作用
　　本部分實驗首先在不同種屬、不同來源的平滑肌細胞(smooth musclecell，SMC)中檢測TGF-β1對KLF4和AT1R表達的影響。再用靶向KLF4的siRNA(siKLF4)和KLF4腺病毒表達載體(pAd-KLF4)分別轉(zhuǎn)染V

9、SMC，在VSMC中敲低KLF4表達或使其過表達的基礎(chǔ)上，檢測TGF-β1對AT1R表達的影響。構(gòu)建AT1R基因啟動子指導(dǎo)的熒光素酶報告基因載體，與KLF4表達質(zhì)粒或siKLF4共轉(zhuǎn)染細胞后，觀察KLF4敲低和過表達對報告基因表達的影響。實驗結(jié)果如下：
　　1.1 在不同種屬的VSMC中，TGF-β1對KLF4和AT1R表達產(chǎn)生不同的影響
　　Western blot分析結(jié)果顯示，在大鼠主動脈VSMC和大鼠肺動脈平滑肌細胞(

10、PASMC)中，TGF-β1以濃度(0.5、1、2、4 ng/mL)和時間(3、6、12、24 h)依賴的方式促進KLF4、抑制AT1R蛋白表達；在人主動脈平滑肌細胞(HASMC)中，TGF-β1以濃度(0.5、1、2、4 ng/mL)和時間(6、12、24 h)依賴的方式抑制KLF4和AT1R蛋白表達。
　　實時定量PCR結(jié)果與上述結(jié)果一致，在大鼠VSMC和PASMC中，TGF-β1以濃度(0.5、1、2、4 ng/mL)和時間

11、(2、4、8、16 h)依賴的方式促進KLF4、抑制AT1R mRNA表達；在HASMC中，TGF-β1以濃度(0.5、1、2、4 ng/mL)和時間(2、4、8、16 h)依賴的方式抑制KLF4和AT1R mRNA表達。
　　1.2 KLF4介導(dǎo)TGF-β1對AT1R蛋白表達的抑制作用
　　用siKLF4和pAd-KLF4分別轉(zhuǎn)染VSMC，在VSMC中敲低KLF4表達或使其過表達的基礎(chǔ)上，檢測TGF-β1對AT1R表達的影

12、響。Western blot分析結(jié)果顯示，敲低內(nèi)源性KLF4表達后，AT1R蛋白表達水平降低，TGF-β1對AT1R的表達沒有明顯影響；過表達KLF4后，AT1R蛋白表達水平明顯升高，TGF-β1對AT1R表達產(chǎn)生明顯的抑制作用。
　　1.3 KLF4介導(dǎo)TGF-β對AT1R啟動子活性的阻抑
　　用siKLF4或GFP-KLF4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細胞，在敲低內(nèi)源性KLF4表達或使其過表達的基礎(chǔ)上，檢測TGF-β信號對AT1R基

13、因啟動子指導(dǎo)的熒光素酶報告基因活性的影響。結(jié)果顯示，敲低內(nèi)源性KLF4的表達后，AT1R基因啟動子活性降低，激活TGF-β信號對該基因的啟動子活性沒有明顯影響；過表達KLF4后，AT1R基因啟動子活性明顯升高，激活TGF-β信號對該基因啟動子活性產(chǎn)生明顯的抑制作用。
　　2.TGF-β1通過調(diào)節(jié)KLF4-Sp1和KLF4-PPAR-γ復(fù)合物在AT1R基因啟動子上的結(jié)合活性抑制AT1R基因表達
　　磷酸化修飾是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白

14、質(zhì)相互作用的主要方式。TGF-β1可通過激活Smad和非Smad信號途徑使KLF4發(fā)生磷酸化修飾而導(dǎo)致其與輔助因子的結(jié)合或解離。上述實驗已經(jīng)闡明，KLF4在TGF-β1抑制AT1R基因表達中發(fā)揮重要的作用，本部分實驗進一步探討在TGF-β1作用下，KLF4如何調(diào)控AT1R基因表達。重點研究TGF-β1對KLF4不同位點磷酸化修飾的影響及其介導(dǎo)途徑，探討KLF4磷酸化修飾對其與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用的影響。
　　2.1 TGF-β1促

15、進KLF4與PPAR-γ相互作用，抑制KLF4與Sp1相互作用
　　免疫共沉淀分析結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，KLF4分別與PPAR-γ、Sp1和NF-κB形成復(fù)合物。VSMC在TGF-β1(2 ng/mL)刺激5、10、20、40 min后，隨著刺激時間的延長，KLF4與PPAR-γ的結(jié)合明顯增加，與Sp1的結(jié)合逐漸減少，交互免疫沉淀也得到相似的結(jié)果。TGF-β1對KLF4與NF-κB間的相互作用沒有明顯影響。
　　2.2 T

16、GF-β1通過激活PKC-δ信號通路誘導(dǎo)KLF4蘇氨酸殘基磷酸化促進Sp1與KLF4解離
　　VSMC經(jīng)TGF-β1(2 ng/mL)刺激5、10、20、40 min后，分別用抗磷酸化絲、蘇、酪氨酸抗體對細胞裂解液進行免疫沉淀后檢測磷酸化KLF4的水平。結(jié)果顯示，隨著TGF-β1刺激時間的延長，KLF4的絲、蘇氨酸磷酸化水平逐漸升高；同時，TGF-β1刺激后，磷酸化型PKC-δ(p-PKC-δ)水平以及KLF4與PKC-δ的相互作

17、用顯著升高。
　　以PKC-δ抑制劑Rottlerin處理VSMC，阻斷PKC-δ信號通路的活化后，再以2 ng/mL的TGF-β1刺激細胞40 min。Western blot結(jié)果顯不，Rottlerin預(yù)處理細胞可顯著抑制KLF4的蘇氨酸磷酸化及其與PKC-δ的相互作用；同時，Rottlerin可阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的Sp1與KLF4解離，但不影響KLF4與PPAR-γ相互作用。用靶向PKC-δ的siRNA(siPKC-δ)敲

18、低內(nèi)源性PKC-δ表達后，TGF-β1對KLF4蘇氨酸磷酸化水平及其與Sp1的結(jié)合不再產(chǎn)生明顯影響。此外，用Rottlerin或siPKC-δ處理VSMC后，TGF-β1對AT1R表達也不再產(chǎn)生明顯影響。以上實驗證明，PKC-δ被TGF-β1激活后，入核與KLF4結(jié)合，使其蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，磷酸化型KLF4與Sp1解離，進而影響AT1R的表達。
　　KLF4蘇氨酸磷酸化位點定點突變實驗證明，轉(zhuǎn)染KLF4蘇氨酸磷酸化位點突變體(

19、T401A、T410/412A)的細胞再用TGF-β1處理時，KLF4蘇氨酸磷酸化水平明顯降低；此外，第401位蘇氨酸突變后，TGF-β1對KLF4與Sp1的結(jié)合不再產(chǎn)生明顯影響。這些結(jié)果提示，TGF-β1通過激活PKC-δ信號通路使KLF4的多位蘇氨酸(T401、T410/412)發(fā)生磷酸化，但第401位蘇氨酸的磷酸化是介導(dǎo)KLF4與Sp1解離的關(guān)鍵位點。
　　2.3 TGF-β1通過激活Smad信號通路誘導(dǎo)KLF4絲氨酸殘基磷

20、酸化，促進KLF4與PPAR-γ相互作用
　　上述實驗結(jié)果提示，TGF-β1誘導(dǎo)的KLF4與PPAR-γ相互作用不是通過PKC-δ信號通路介導(dǎo)的，即與KLF4蘇氨酸位點的磷酸化無關(guān)。我室以前的研究結(jié)果表明，TGF-β1可通過激活Smad信號通路誘導(dǎo)KLF4絲氨酸殘基磷酸化，因此，我們推測，TGF-β1可能通過激活Smad信號通路誘導(dǎo)KLF4絲氨酸殘基磷酸化進而促進KLF4與PPAR-γ相互作用。為此，用SB431542處理VSMC

21、，特異性阻斷Smad信號通路的活化后，再以2 ng/mL TGF-β1刺激細胞40 min。免疫共沉淀分析結(jié)果顯示，在SB431542預(yù)孵育的VSMC中，TGF-β1對KLF4絲氨酸磷酸化及其與PPAR-γ的結(jié)合不再產(chǎn)生明顯影響，卻仍然能促進Sp1與KLF4解離。用靶向Smad2或Smad3的siRNA(siSmad2或siSmad3)敲低內(nèi)源性Smad2、Smad3表達后，TGF-β1對KLF4與PPAR-γ相互作用不再產(chǎn)生明顯影響。

22、此外，用SB431542、siSmad2或siSmad3處理VSMC后，TGF-β1對AT1R的表達也不再產(chǎn)生明顯影響。上述結(jié)果表明，TGF-β1通過激活Smad信號通路誘導(dǎo)KLF4絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，絲氨酸位點發(fā)生磷酸化的KLF4能募集PPAR-γ與之相結(jié)合，進而影響AT1R基因的表達。
　　KLF4絲氨酸磷酸化位點定點突變實驗也證明了上述結(jié)論，轉(zhuǎn)染KLF4絲氨酸磷酸化位點突變體(S470A)的細胞再用TGF-β1處理時，

23、KLF4絲氨酸磷酸化水平及其與PPAR-γ相互作用均明顯降低。
　　2.4 Sp1促進KLF4對AT1R基因的轉(zhuǎn)錄激活，PPAR-γ抑制KLF4對AT1R基因的轉(zhuǎn)錄激活
　　為了檢查KLF4與Sp1或PPAR-γ相互作用在調(diào)節(jié)AT1R基因表達中的意義，我們進行了報告基因分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF4和Sp1均能促進AT1R基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；KLF4和Sp1表達載體共轉(zhuǎn)染使AT1R基因啟動子活性比轉(zhuǎn)染其中一種表達質(zhì)粒明顯升高，但

24、同時激活TGF-β信號后，該基因啟動子活性明顯降低；單獨轉(zhuǎn)染PPAR-γ表達質(zhì)粒對AT1R基因啟動子活性沒有明顯影響；KLF4和PPAR-γ表達載體共轉(zhuǎn)染細胞時，PPAR-γ過表達能明顯抑制KLF4對AT1R基因啟動子的激活作用，同時激活TGF-β信號后，AT1R基因啟動子活性下降的更加明顯。
　　AT1R基因啟動子區(qū)-1423/+33序列中包含4個KLF4結(jié)合位點(TCE1、TCE2、TCE3、TCE4)和1個Sp1結(jié)合元件(G

25、C-box)。為了觀察KLF4是通過哪個/些位點對AT1R基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，我們分別對上述5個位點進行缺失突變，并進行報告基因分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失TCE4元件后，KLF4對AT1R基因的轉(zhuǎn)錄激活作用及Sp1和KLF4的協(xié)同激活作用消失，PPAR-γ質(zhì)粒無論單獨轉(zhuǎn)染還是與KLF4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，對AT1R基因啟動子活性均沒有明顯影響。
　　2.5 TGF-β1使KLF4、Sp1和PPAR-γ在AT1R基因啟動子上的裝配發(fā)生改變
　

26、　上述結(jié)果表明，TCE4元件是KLF4、Sp1和PPAR-γ對AT1R基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵位點，提示，TGF-β1可能通過影響這幾種轉(zhuǎn)錄因子在TCE4元件上的裝配來調(diào)控AT1R基因的表達。為了證明這點，我們進行了染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VSMC在TGF-β1刺激5、10、20、40 min后，隨著刺激時間的延長，KLF4和PPAR-γ與TCE4兀件的結(jié)合明顯增加，在刺激20、40 min后增加最明顯；Sp1與TCE4

27、元件的結(jié)合逐漸減少，在刺激10 min后明顯減少，刺激20 min后，幾乎檢測不到結(jié)合，用Rottlerin阻斷PKC-δ信號的活化后，TGF-β1對Sp1與TCE4元件的結(jié)合不再產(chǎn)生影響。Oligo pull-down分析結(jié)果進一步證實，TGF-β1抑制Sp1與TCE4元件的結(jié)合，促進KLF4和PPAR-γ與該元件的結(jié)合。
　　連續(xù)ChIP分析結(jié)果進一步顯示，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，在用Sp1抗體再次沉淀KLF4抗體沉淀得到的染色質(zhì)片段或

28、用KLF4抗體再次沉淀Sp1抗體沉淀得到的染色質(zhì)片段時，二次沉淀物中仍能擴增得到含TCE4元件的DNA片段，TGF-β1刺激VSMC 40 min后，二次沉淀物中不能擴增出上述DNA片段。按相同的方法，用KLF4和PPAR-γ抗體進行交互連續(xù)ChIP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，二次沉淀物中不能擴增出含TCE4元件的DNA片段，但在TGF-β1刺激的VSMC中，二次沉淀物中可檢測到上述DNA片段。以上結(jié)果表明，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，KLF4與S

29、p1在TCE4元件上形成復(fù)合物，協(xié)同促進AT1R基因表達；TGF-β1刺激后，Sp1與KLF4解離，同時KLF4與PPAR-γ形成復(fù)合物，結(jié)合于該元件上，抑制AT1R基因的轉(zhuǎn)錄。
　　3.TGF-B1通過下調(diào)AT1R表達抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC增殖
　　上述實驗主要對TGF-β1抑制AT1R基因轉(zhuǎn)錄的機制進行了深入研究。本部分實驗進一步探討TGF-β1抑制AT1R表達對VSMC增殖的影響。
　　3.1 TGF-β1

30、促進VSMC標(biāo)志基因表達
　　Western blot結(jié)果表明，TGF-β1顯著抑制AT1R蛋白表達，并具有明顯的時效(6、12、24、48 h)和量效(0.5、1、2、4 ng/mL)關(guān)系。以TGF-β1濃度為2 ng/mL作用于VSMC 48 h的抑制作用最強。
　　SM22α和SMα-actin表達是VSMC處于分化狀態(tài)的重要分子標(biāo)志，PCNA表達是VSMC處于增殖狀態(tài)的重要分子標(biāo)志。采用Western blot分析，

31、檢測TGF-β1對VSMC標(biāo)志基因表達的影響。結(jié)果顯示，TGF-β1以濃度(0.5、1、2、4 ng/mL)和時間(6、12、24、48 h)依賴的方式促進分化標(biāo)志基因SM22α和SMα-actin表達，抑制增殖標(biāo)志物PCNA表達。
　　3.2 TGF-β1抑制VSMC增殖
　　BrdU摻入分析實驗結(jié)果顯示，TGF-β1以濃度(0.5、1、2、4 ng/mL)和時間(6、12、24、48 h)依賴的方式抑制VSMC增殖，以T

32、GF-β1濃度為2 ng/mL作用于VSMC 48 h的抑制作用最強。
　　3.3 TGF-β1通過下調(diào)AT1R表達抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC增殖
　　在VSMC中，Ang Ⅱ通過與AT1R相互作用激活細胞增殖信號，促進細胞增殖。因此，AT1R表達異?？捎绊慉ng Ⅱ的促增殖活性。TGF-β1既然能抑制AT1R表達，是否能抑制Ang Ⅱ的促增殖活性呢?為此，我們用2 ng/mL的TGF-β1預(yù)孵育VSMC 6 h后，再以A

33、ng Ⅱ(10-7M)刺激細胞24 h。Western blot結(jié)果顯示，Ang Ⅱ抑制SM22α和SMα-actin表達，促進PCNA表達；TGF-β1能消除Ang Ⅱ?qū)M22α和SMα-actin表達的抑制作用，同時阻斷Ang Ⅱ?qū)CNA表達的促進作用。BrdU摻入分析實驗結(jié)果顯示，在以TGF-β1預(yù)孵育的VSMC中，Ang Ⅱ的促增殖作用明顯降低。
　　前面的實驗證實，在TGF-β1作用前后，KLF4與Sp1和PPAR-

34、γ以不同的組合方式調(diào)節(jié)AT1R基因表達。我們進一步檢測這幾種轉(zhuǎn)錄因子在TGF-β1抑制VSMC增殖中的作用。用靶向KLF4、Sp1和PPAR-γ的siRNA(siKLF4、siSp1和siPPAR-γ)單獨或聯(lián)合轉(zhuǎn)染VSMC，在VSMC中敲低這幾種轉(zhuǎn)錄因子表達的基礎(chǔ)上，用BrdU摻入分析實驗檢測TGF-β1對細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低內(nèi)源性KLF4或/和PPAR-γ表達，能阻斷TGF-β1的抗增殖作用；相反，敲低內(nèi)源性Sp1表達后，

35、TGF-β1的抗增殖作用更加明顯。這些結(jié)果表明，Sp1與KLF4的解離以及KLF4與PPAR-γ的結(jié)合在TGF-β1抑制VSMC增殖中發(fā)揮重要的作用。
　　結(jié)論：KLF4介導(dǎo)TGF-β1對AT1R基因表達的抑制作用；TGF-β1通過激活PKC-δ信號通路誘導(dǎo)KLF4蘇氨酸殘基磷酸化而促進Sp1與KLF4解離；TGF-β1通過激活Smad信號通路誘導(dǎo)KLF4絲氨酸殘基磷酸化而促進KLF4與PPAR-γ相互作用；在基礎(chǔ)狀態(tài)下，Sp1與