RhoA激酶1在氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)足細胞損傷中的作用.pdf

1、慢性腎臟疾病(CKD)在中國普通人群患病率高達11.8％-13.0％，與之相應(yīng)，中國每年新增腎臟替代治療患者人數(shù)不斷攀升，如何延緩CKD患者腎功能進展成為亟需解決的難題。近年研究證明脂質(zhì)異常是公認的促進CKD持續(xù)進展的獨立危險因素。隨著高脂血癥發(fā)生率的增加，脂質(zhì)對腎臟的不良影響，特別是對合并CKD患者腎毒性日益受到重視。深入研究脂質(zhì)腎臟損傷的分子機制不僅可以加深對脂質(zhì)腎毒性的理論認識，也有助于獲得防治和延緩CKD持續(xù)進展的新思路。

2、>　　1982年，Moorhead提出“脂質(zhì)腎毒性”假說:腎小球病變所引起的高脂血癥和蛋白尿會導(dǎo)致腎臟疾病持續(xù)的進展，而且脂質(zhì)的異常會同時造成動脈粥樣硬化和腎小球硬化的形成，腎小球硬化和動脈粥樣硬化是一系列相互存在聯(lián)系的臨床疾病中的一部分。我們的實驗通過體外培養(yǎng)的小鼠腎小球足細胞首次發(fā)現(xiàn)，小鼠足細胞表達ROCK1，ox-LDL(oxidized low-density lipoprotein)刺激能調(diào)節(jié)足細胞上ROCK1的活性并使裂孔膜

3、蛋白nephrin的表達下降。這個結(jié)果表明腎小球足細胞也許通過提高ROCK1的活性來參與脂質(zhì)腎臟損傷。但有關(guān)ox-LDL介導(dǎo)足細胞損傷的具體調(diào)控機制，尚未得到深入的研究。
　　Rho激酶(ROCK)是RhoA下游最為重要的效應(yīng)分子之一，它是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，有ROCK1和ROCK2兩個異構(gòu)體，可以被GTP結(jié)合蛋白RhoA激活（與GTP結(jié)合時被激活，與GDP結(jié)合時失活），激活的ROCK可以使其底物如肌球蛋白輕鏈、LIM激酶、埃

4、茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白、肌球蛋白磷酸化亞單位(MYPT)等磷酸化，在細胞收縮、中性粒細胞遷徙、神經(jīng)細胞生長發(fā)育和細胞凋亡過程中發(fā)揮極為重要的作用。有實驗表明通過抑制ROCK的表達可以增加自噬小體的體積，進而促進自噬的發(fā)生。另外有研究顯示在體外使用ROCK抑制劑Y-27632可以顯著增加細胞蛋白分解、減少異常蛋白質(zhì)的積聚，也可以激活細胞內(nèi)的其他蛋白酶如泛素蛋白酶系統(tǒng)，增加自吞噬作用，促進細胞的異常增多的物質(zhì)的消化和分解。
　　目的

5、:
　　本研究是通過在體外實驗建立ox-LDL誘導(dǎo)的足細胞脂質(zhì)損傷模型，來觀察ox-LDL對小鼠足細胞ROCK1活性及nephrin表達的影響;并且通過使用ROCK1siRNA和wt ROCK1質(zhì)粒來雙向調(diào)節(jié)ROCK1來探討ROCK1對足細胞攝取脂質(zhì)、足細胞膽固醇含量的影響以及nephrin、LC3-Ⅱ、P62、p-ULK1(Ser757)表達的關(guān)系，初步來探討ROCK1參與脂質(zhì)腎臟損傷的發(fā)病機制。
　　方法:
　　一

6、、小鼠的足細胞培養(yǎng)、鑒定以及處理分組
　?。ㄒ唬┬∈蟮淖慵毎囵B(yǎng)方法
　　永生化條件下的足細胞(MPC)復(fù)蘇后，使用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基和20-100U/mL重組的小鼠γ干擾素在5％CO2，在33℃條件下誘導(dǎo)增殖和傳代。后續(xù)轉(zhuǎn)入5％CO2，37℃培養(yǎng)箱分化等待成熟。
　?。ǘ┬∈笞慵毎螒B(tài)學(xué)的觀察以及鑒定
　　將33℃的培養(yǎng)箱和37℃的培養(yǎng)箱中的足細胞在倒置相差顯微鏡下拍片，并觀察比較兩者之

7、間的形態(tài)學(xué)差異;采用足細胞特異性骨架蛋白synaptopodin免疫染色來確定足細胞是否已經(jīng)分化成熟了，成熟的足細胞表達并且延著細胞骨架清晰分布。
　?。ㄈ┏墒熳慵毎奶幚矸纸M
　　(1)Ox-LDL刺激對足細胞ROCK1活性影響
　　(2)調(diào)控ROCK1的表達對p-MYPT/MYPT、nephrin等表達、足細胞攝取脂質(zhì)，細胞膽固醇濃度的影響
　　檢測內(nèi)容
　　使用酶法檢測足細胞膽固醇含量;Wester

8、n Blot檢測p-MYPT/MYPT、Nephrin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ等的蛋白表達水平;使用免疫熒光的方法來檢測足細胞中脂質(zhì)的變化情況。
　　四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±SD)表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間結(jié)果比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法。
　　結(jié)果:
　　與正常對照組相比，ox-LDL刺激上調(diào)足細胞ROCK活性增加（p-M

9、YPT表達升高），同時伴有nephrin、LC3-Ⅱ表達下降(p＜0.05)，P62、p-ULK1表達上升（p均＜0.05），細胞內(nèi)膽固醇含量增加(p＜0.05);抑制ROCK1表達能抑制ox-LDL誘導(dǎo)的p-MYPT水平上調(diào)，同時上調(diào)nephrin、LC3-Ⅱ的表達(p＜0.05)，下調(diào)P62、p-ULK1的表達（p均＜0.05），降低細胞內(nèi)膽固醇含量(p＜0.05);與之相反，增加ROCK1表達能進一步增加ox-LDL誘導(dǎo)的p-MY