舒血寧注射液對氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細胞的保護作用.pdf

1、研究目的:
　　 本實驗通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)原代及傳代培養(yǎng)的方法,并對所培養(yǎng)細胞進行鑒定;利用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein ox-LDL)對所培養(yǎng)的HUVEC造成脂質(zhì)過氧化損傷,觀察舒血寧注射液對內(nèi)皮細胞的保護作用并探討其可能的作用機制。
　　 研究方法;
　　 取新鮮臍帶的靜脈內(nèi)皮細胞進行體外原代及傳代培養(yǎng),并對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定;

2、建立脂質(zhì)過氧化損傷模型,以加藥的不同分為:空白對照組、ox-LDL損傷組、舒血寧加ox-LDL組(將細胞用舒血寧注射液預(yù)處理24h,然后加入ox-LDL)、生理鹽水加ox-LDL組(將細胞用生理鹽水預(yù)處理24h,然后加入ox-LDL)。采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測細胞相對數(shù)和相對活力;用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)觀察ox-LDL刺激在0h、3h、12h、24h時,對內(nèi)皮細胞ICAM-1、MCP-1的蛋白質(zhì)水平的影響,用蛋白質(zhì)

3、免疫印記技術(shù)(WesternBlot)觀察ox-LDL刺激12h時對人臍靜脈內(nèi)皮細胞ICAM-1、MCP-1蛋白質(zhì)水平的影響;以及用舒血寧注射液干預(yù)后上述因子的變化。根據(jù)其結(jié)果分析舒血寧注射液對血管內(nèi)皮細胞的保護作用及其可能的作用機制。所有量化數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進行分析。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)MTT法檢測內(nèi)皮細胞相對數(shù)和相對活力:ox-LDL與HUVEC共同孵育24h后其HUVEC的活性降低,其OD

4、值與對照組相比顯著下降(P＜0.01),舒血寧注射液組的OD值明顯高于ox-LDL組(p＜0.01);生理鹽水組與ox-LDL損傷組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。測得ox-LDL損傷組細胞存活率為50.41±0.002％,與空白對照組相比顯著下降(p＜0.01);舒血寧注射液組為81.82±0.001％,與ox-LDL損傷組比較有顯著性差異(p＜0.01);生理鹽水組為49.59±0.014％,與ox-LDL損傷組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意

5、義(P＞0.05)。
　　 (2)舒血寧注射液對ox-LDL處理的HUVEC形態(tài)學(xué)的影響:在倒置顯微鏡下觀察,空白對照組的HUVEC呈單層,其邊界清楚,胞質(zhì)豐富,互不重疊,成典型的鋪路石樣鑲嵌排列;在與ox-LDL共同孵育以后其細胞收縮,細胞間隙增寬,細胞膜皺縮,可見有部分細胞脫落,細胞的邊界不清楚;舒血寧注射液組的細胞形態(tài)趨于正常,其間隙變窄,但與正常相比仍有差異,;生理鹽水組細胞間隙增寬,細胞膜收縮,部分細胞脫落。
　

6、　 (3)舒血寧對ox-LDL誘導(dǎo)HUVECICAM-1和MCP-1蛋白質(zhì)表達的影響
　　 酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELlSA)檢測ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC中ICAM-1、MCP-1蛋白質(zhì)表達增加,給予舒血寧注射液干預(yù)后其蛋白質(zhì)表達降低。檢測顯示ox-LDL刺激后在各個時間點ICAM-1、MCP-1表達均有所增高,差異有顯著性(P＜0.01),3h、6h、12h、24h各時間點與空白對照組相比,ICAM-1水平分別提高28.9

7、％、44.7％、89.9％、81.9％,MCP-1水平分別提高30.7％、57.9％、130％、120％,其中以12h組增高最為明顯;與ox-LDL損傷組比較,給予舒血寧注射液后ICAM-1、MCP-1表達在各時間點均有所下降,ICAM-1在3h、6h、12h、24h各時間點分別下降7.13％、13.2％、27.5％、51.9％;MCP-1在3h、6h、12h、24h各時間點分別下降10.7％、9.93％、47％、57.6％;而給予生理

8、鹽水后與ox-LDL損傷組相比差異不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 WesternBlot蛋白印記分析法顯示:與空白對照組相比在ox-LDL刺激HUVEC后可使其炎癥因子ICAM-1、MCP-1蛋白質(zhì)表達明顯上調(diào),與ox-LDL損傷組相比給予舒血寧注射液后ICAM-1、MCP-1的蛋白質(zhì)表達明顯下調(diào),差異有顯著性(P＜0.01);而給予生理鹽水后與ox-LDL,損傷組相比差異不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　

9、 (1)ox-LDL對HUVEC有細胞毒性作用,可抑制細胞生長,并且可引起內(nèi)皮細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變;
　　 (2)舒血寧注射液對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC形態(tài)學(xué)有抑制作用;且可以提高ox-LDL氧化損傷HUVEC細胞的存活率;
　　 (3)ox-LDL作用于HUVEC可上調(diào)ICAM-1、MCP-1蛋白質(zhì)的表達,而舒血寧注射液對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECICAM-1、MCP-1表達改變有一定的逆轉(zhuǎn)作用,而起到對血管內(nèi)皮細