解毒活血方含藥血清對(duì)氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞及相關(guān)因子影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：冠心病(CHD)是臨床常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康。因此，如何防治冠心病是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家研究的重點(diǎn)課題之一。 冠心病的病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化(AS)。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)AS發(fā)病機(jī)理的研究涉及脂質(zhì)浸潤、內(nèi)皮損傷、血栓形成等方面，近年來尤其對(duì)氧化應(yīng)激、炎癥學(xué)說探討較多。越來越多的研究資料表明：冠心病與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，兩者相互作用、相互影響，共同導(dǎo)致了冠心病的發(fā)生與發(fā)展。熱毒學(xué)說是中醫(yī)學(xué)對(duì)冠心病病機(jī)的一種重

2、要認(rèn)識(shí)。該學(xué)說認(rèn)為熱毒瘀于脈絡(luò)，阻滯心脈氣血運(yùn)行，絡(luò)脈瘀阻，毒瘀互結(jié)，而致胸痹心痛。大量研究證實(shí)，熱毒與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。AS過程中所產(chǎn)生的符種細(xì)胞因子、脂質(zhì)過氧化物均屬于中醫(yī)“內(nèi)生毒邪”的范疇。 目前普遍認(rèn)為，內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵步驟，它不僅導(dǎo)致AS形成，而且對(duì)AS進(jìn)展及并發(fā)癥(如血管痙攣、血栓形成)有重要作用?？笰S的關(guān)鍵目標(biāo)就足保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞(EC)免受各種危險(xiǎn)因素侵害。而氧化低密度脂蛋白(ox-LDL

3、)作為重要的氧自由基攜帶者，足內(nèi)皮損傷的主要機(jī)制。 鑒于以上，我們根據(jù)胸痹熱毒學(xué)說確立了解毒活血法，并據(jù)此法組成解毒活血方，使其含藥血清作用于ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，并檢測超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等指標(biāo)的變化，從抗氧化、抗炎角度探討解毒活血法對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，為臨床治療冠心病提供

4、理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.MTT法觀察細(xì)胞增殖情況：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化后以2×105cell/ml的密度接利于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長至約80％)后，同步化培養(yǎng)24小時(shí)，分為4組：(1)空白對(duì)照組：加入20％空白血清+5％新生牛血清培養(yǎng)液(2)病理模型組：加入20％空白血清+100mg/L ox-LDL+5％新生牛血清培養(yǎng)液(3)解毒活血方含藥血清低劑量組：加入10％解毒活血方含藥血清+10％空白血清+100

5、mg/L ox-LDL+5％新生牛血清培養(yǎng)液(4)解毒活血方含藥血清高劑量組：加入20％解毒活血方含約血清+100mg/L ox-LDL+5％新生牛血消培養(yǎng)液。培養(yǎng)24小時(shí)后，MTT法觀察細(xì)胞增殖情況。 2培養(yǎng)上清液SOD、MDA、NO、ET-1、TNF-α含最的測定：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化后以2×105cell/ml的密度接種于24孔培養(yǎng)板，余步驟同上，分組培養(yǎng)24小時(shí)后，測定上清液中SOD、MDA、NO、ET-1、TNF-α

6、含量。 3.免疫組化法測定ICAM-1表達(dá)：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化后以2×104 cell/ml的密度接種于預(yù)先放有處理過玻片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，同步化培養(yǎng)24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)分組及所加液體同上，24小時(shí)后，夾出蓋玻片，PBS洗滌2次后放入冷丙酮固定10min，取出干燥后細(xì)胞面朝上用中性樹脂膠封于載玻片上，免疫組化法測定ICAM-1表達(dá)。 結(jié)果： 1.MTT法觀察細(xì)胞增殖情況：解毒活血方含藥血消低劑量組(0

7、.78±0.017)、解毒活血方含藥血清高劑最組(0.79±0.024)與病理模型組(0.62±0.058)相比，0D值均顯著升高(P＜0.01)。 2.培養(yǎng)上清液中超氧化物歧化酶含量：解毒活血方含藥血清低劑量組(63.57±1.63)、解毒活血方含藥血清高劑量組(67.63±2.95)與病理模型組(58.26±1.34)相比均顯著升高(P＜0.01)。 培養(yǎng)上清液中丙二醛含量：解毒活血方含藥血清低劑量組(6.87±1.

8、26)、解毒活血方含藥血清高劑量組(6.83±0.46)與病理模型組(10.02±1.66)相比均顯著降低 (P＜0.01)。 3.培養(yǎng)上清液中一氧化氮含量：解毒活血方含藥血清低劑量組(1.86±0.19)與病理模型組(2.34±0.18)相比顯著降低(P＜0.01)；解毒活血方含藥血清高劑量組(2.07±0.21)與病理模型組相比也顯著降低(P＜0.05)。 培養(yǎng)上清液中內(nèi)皮素-1含量：解毒活血方含藥血清低劑量組(57

9、.20±16.12)、解毒活血方含藥血清高劑量組(42.97±5.58)與病理模型組(173.84±11.29)相比均顯著降低(P＜0.01)。 4培養(yǎng)上消液中腫瘤壞死因子-α含最：解毒活血方含藥血清低劑量組(0.58±0.03)與病理模型組(0.68±0.09)相比顯著降低(P＜0.05)；解毒活血方含藥血清高劑量組(0.43±0.04)與病理模型組相比也顯著降低(P＜0.01)。 5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測ICAM-1

10、表達(dá)：解毒活血方含藥血清低劑量組(0.446±0.020)、解毒活血方含藥血清高劑量組(0.400±0.043)與病理模型組(0.507±0.064)相比均顯著降低(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.通過實(shí)驗(yàn)，證實(shí)在“解毒活血法”原則指導(dǎo)下選用的方藥具有拮抗ox-LDL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的作用。其機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過氧化、抑制或減少炎癥因子的釋放有關(guān)。從而為臨床防治冠心病提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步證