低密度脂蛋白與血小板免疫活化的關(guān)聯(lián)及對血管內(nèi)皮細(xì)胞動脈粥樣硬化相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、本課題研究如下： 1、檢測高LDL-C患者氟伐他汀治療前后血脂水平和血小板PAC-1及CD40L表達(dá)；觀察高LDL—C患者血漿對體外血小板PAC—1及CD40L表達(dá)的影響及氟伐他汀的干預(yù)作用；用LDL直接或輔助刺激血小板，氟伐他汀干預(yù)，觀察LDL對血小板CD40L及PAC—1表達(dá)的影響及氟伐他汀的作用。 2、用免疫活化的血小板與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)加或不加LDL共孵育，實時定量RT—PCR、Western B

2、LOT、ELISA、核因子活性檢測等技術(shù)觀察HUVECsCOX-2及PPAR—α的表達(dá)情況并探討LDL的作用。 3、相應(yīng)的拮抗劑CD40L單抗阻斷CD40/CD40L通路及重組人CD40L(rhCD40L)直接刺激HUVECs模擬激活CD40-CD40L通路，觀察HUVECs COX-2及PPAR—α的表達(dá)，探究其作用途徑及機制。 第一部分血脂對血小板免疫活化的影響 目的:利用流式細(xì)胞術(shù)、RT—PCR、WESTE

3、N BLOT、ELISA等方法觀察高LDL—C患者氟伐他汀治療前后血小板PAC-1及CD40L表達(dá)情況；觀察高LDL—C患者血漿和單純LDL對體外健康人血小板PAC—1、CD40L表達(dá)的影響及氟伐他汀的作用，探討高脂血癥患者血小板免疫活化的變化，LDL對血小板免疫活化的影響及氟伐他汀干預(yù)的作用和機制。 材料和方法: 1.購買機采血小板，過濾白細(xì)胞，使血小板達(dá)到實驗所需質(zhì)量要求，并對其進(jìn)行體外保存培養(yǎng)。 2.選擇2

4、0例LDL-C明顯升高而甘油三酯不高(triglycerin，TG)的單純高LDL血癥患者，氟伐他汀治療4周(40mg/日)，治療前后均對血脂、血小板PAC—1及CD40L表達(dá)進(jìn)行檢測。 3.用3例高LDL—C患者血漿體外培養(yǎng)健康人血小板并用氟伐他汀進(jìn)行干預(yù)，檢測血小板表面PAC-1、及CD40L表達(dá)情況，研究高LDL-C患者血漿對血小板PAC—1及CD40L表達(dá)的影響及氟伐他汀的干預(yù)作用。 4.用LDL和/或ADP干預(yù)

5、體外培養(yǎng)血小板，并用氟伐他汀進(jìn)行干預(yù)，流式細(xì)胞術(shù)、RT—PCR及WESTERN Blot等技術(shù)檢測血小板CD40L mRNA及蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步探索LDL對血小板免疫活化的影響及氟伐他汀干預(yù)作用。 小結(jié): 本研究發(fā)現(xiàn)高LDL-C患者血小板PAC-1及CD40L的表達(dá)較正常對照組明顯升高，說明高LDL-C患者血小板免疫活性增加或處于一定程度的免疫活化狀態(tài)，通過LDL-C濃度與血小板PAC-1及CD40L表達(dá)量的直線回歸分析

6、發(fā)現(xiàn)兩者具有線性關(guān)系，也說明了LDL-C與血小板免疫活化有關(guān)。氟伐他汀治療一個月后，患者LDL-C降低的同時，血小板PAC-1及CD40L的表達(dá)較治療前也明顯降低，說明氟伐他汀在降低LDL-c的同時，也抑制了血小板的免疫活化。 第二部分免疫活化血小板與LDL對HUVECs COX-2、PPAR-α表達(dá)及活性的影響 目的:通過血小板與HUVECs加或不加LDL的共孵育，體外觀察ADP激活血小板對HUVECs COX-2和P

7、PAR-α表達(dá)的影響及LDL的作用。 方法: 1.HUVECs培養(yǎng)將HUVECs株復(fù)蘇后置于5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)傳代，貼壁24小時后細(xì)胞外觀形態(tài)由扁變薄，體積增大、核清晰，數(shù)目增多，部分呈現(xiàn)多邊形，聚集的細(xì)胞逐漸分散形成明顯的細(xì)胞間隙，大約48-72小時呈分布均勻而密布的細(xì)胞單層。臺盼藍(lán)染色法計算細(xì)胞存活率在95％以上。在實驗干預(yù)前，采用細(xì)胞計數(shù)板將細(xì)胞調(diào)整為2×106濃度，放入6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行

8、實驗干預(yù)。 2.血小板的保存培養(yǎng)及與內(nèi)皮細(xì)胞的共孵育從血液中心購取機采血小板，用白細(xì)胞過濾器進(jìn)行進(jìn)一步白細(xì)胞過濾，并進(jìn)行血小板計數(shù)及白細(xì)胞、紅細(xì)胞含量測定(方法同前)，用血小板專用保存袋在血小板震蕩保存機中22℃水平振蕩條件下保存。實驗前用22℃PBS液洗滌、22℃、4000G、10分鐘離心，反復(fù)2次后，將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×107/ml，用RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中短時間與HUVECs共孵育。

9、 3.血小板活化方法血小板在ADP的作用下激活，PAC-1表達(dá)增加，同時CD40L的表達(dá)也會增加，因血小板CD40L廣泛參與了免疫炎癥反應(yīng)，稱之為免疫活化，為達(dá)到較多血小板活化數(shù)量本研究采用了終濃度為5μ mol/L的ADP活化血小板。 小結(jié):本研究通過免疫活化血小板與HUVECs共孵育培養(yǎng)來觀察免疫活化血小板對HUVECs的直接作用，觀察其對HUVECs COX-2、PPARα表達(dá)及活性的影響，并同時觀察LDL在其中的作用。結(jié)

10、果發(fā)現(xiàn)ADP活化的血小板既能明顯促進(jìn)HUVECs COX-2的表達(dá)，也能明顯促進(jìn)PPARα表達(dá)，COX-2表達(dá)升高的同時，其活性也明顯升高，但PPARα在表達(dá)升高的同時，其活性并沒有明顯升高；而未活化的血小板在培養(yǎng)時間內(nèi)對HUVECs COX-2及PPARα表達(dá)及活性無明顯作用，這些結(jié)果表明了免疫活化的血小板可能會通過血管內(nèi)皮細(xì)胞COX-2的表達(dá)及活性升高參與AS的發(fā)生、發(fā)展 第三部分：CD40/CD40L通路在免疫活化血小板對

11、HUVECs COX-2、PPAR-α表達(dá)中的作用 目的:血小板上有CD40L的表達(dá)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞上有CD40受體的表達(dá)，通過在免疫活化血小板與HUVECs共孵育培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，預(yù)先在相應(yīng)組加入抗人CD40L單克隆抗體(CD40L mAb)，阻斷CD40L-CD40通路，觀察通路阻斷的相應(yīng)效果，然后用重組人CD40L(rhCD40L)直接刺激HUVECs觀察有無相應(yīng)的擬效應(yīng)，來研究CD40/CD40L通路在免疫活化血小板促進(jìn)HU

12、VECs COX-2、PPAR-α表達(dá)中的作用。 方法: 1.HUVECs培養(yǎng)同第二部分。 2.血小板的保存培養(yǎng)及與內(nèi)皮細(xì)胞的共孵育同第二部分。 3.血小板活化方法同第二部分。 小結(jié): 血小板在免疫活化后CD40L表達(dá)增多，同時伴有sCD40L的釋放，sCD40L能發(fā)揮CD40L同樣的生物學(xué)作用。研究證明血管內(nèi)皮細(xì)胞上有CD40受體的表達(dá)，本研究也證實了這一點。有研究認(rèn)為CD40L與CD4

13、0相互作用能使內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子E-選擇素、VCAM-1、ICAM-1和TF、MCP-1的表達(dá)增高。本研究在免疫活化血小板與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育的基礎(chǔ)上，加入CD40L/CD40通路的阻斷劑，或用rhCD40L直接刺激HUVECs，對CD40/CD40L通路進(jìn)行干預(yù)，觀察免疫活化血小板促進(jìn)HUVECs COX-2及PPARα的表達(dá)與CD40L、CD40通路有無關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預(yù)先加入CD40L，mAb情況下COX-2的表達(dá)明顯降低，而且用rhC

14、D40L直接干預(yù)HUVECs也明顯促進(jìn)COX-2的表達(dá)，說明免疫活化血小板促進(jìn)HUVECs COX-2的表達(dá)可能部分是通過CD40L/CD40通路實現(xiàn)的。 總結(jié)論: 1.高LDL-C患者血小板PAC-1及CD40L表達(dá)增加，氟伐他汀治療后血小板PAC-1及CD40L表達(dá)明顯降低，血漿LDL-C濃度與血小板PAC-1及CD40L陽性表達(dá)率有直線相關(guān)性。 2.體外高LDL-C血漿促進(jìn)健康人血小板PAC-1及CD40L

15、的表達(dá)，氟伐他汀不能降低血小板PAC-1及CD40L的表達(dá)，LDL-C的濃度與血小板PAC-1及CD40L表達(dá)陽性率具有線性關(guān)系。 3.單純LDL(5μg/mL-50μg/mL)不能促進(jìn)血小板免疫活化的增加，但LDL能促進(jìn)ADP激活血小板，顯著增加血小板的免疫活化，其CD40L蛋白的表達(dá)和培養(yǎng)液中sCD40L的濃度較單純等濃度的ADP刺激顯著增加。LDL的這種作用可能與其增加了血小板對激活物的敏感性有關(guān)。 4.免疫活化血

16、小板能夠促進(jìn)HUVECs COX-2的表達(dá)及COX-2活性的增加。 5.免疫活化血小板亦促進(jìn)HUVECs PPARα的表達(dá)，但PPARα活性無明顯增加。 6.單純LDL(5μg/mL-50μg/mL)不能影響HUVECs COX-2及PPARα的表達(dá)，亦不能促進(jìn)它們活性的增加，但較高濃度的LDL(50μg/mL)能夠顯著促進(jìn)免疫活化的血小板刺激HUVECs表達(dá)COX2及PPARα的作用。 7.CD40L mAb能

17、夠部分抑制免疫活化血小板促進(jìn)HUVECs COX-2表達(dá)及COX-2活性的增加，單純CD40受體擬激動劑rhCD40L亦能夠一定程度直接激活HUVECs，促進(jìn)COX-2的表達(dá)和COX-2活性的增加，表明免疫活化血小板促HUVECs COX-2表達(dá)及活性升高部分是通過CD40-CD40L通路實現(xiàn)的。 8.CD40L mAb能夠部分抑制免疫活化血小板促進(jìn)HUVECs PPARα的表達(dá)，但是單純CD40受體擬激動劑rhCD40L不能明