IAP家族蛋白Livin在細胞凋亡中的作用機制研究.pdf

1、細胞凋亡(也叫程序性細胞死亡)，是一種由基因控制的主動性的細胞死亡過程，它對于維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定是至關重要的。Livin(又稱ML-IAP和KIAP)是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAP)家族的一個成員，它含有一個IAP家族特征性的桿狀病毒IAP重復序列(baculoviralIAPrepeat，BIR)結構域和羧基端的環(huán)狀鋅指樣結構區(qū)域(RINGzinc-fingerdomain)。已有報

2、道指出，Livin可以通過其BIR結構域在體外直接與caspase-3和-7結合、在體內與caspase-9結合及與促凋亡因子Smac/DIABLO相互作用。且Livin是個相對弱的caspases抑制子，關于這個分子的更為詳細的抗凋亡的機制需要進一步的研究和闡明，為此，我們進行了下面的研究并得出了一些結論。 在本研究中，我們首次證實了Livin可以充當E3泛素連接酶并可以泛素化降解Smac/DIABLO。體內和體外的實驗證明

3、，Livin的BIR結構域和RING區(qū)域對于Livin泛素化降解Smac/DIABLO是必不可缺少的。 我們也發(fā)現，Livin是個不穩(wěn)定的蛋白，其半衰期為4小時。泛素蛋白酶抑制劑MG132或ALLN可以阻斷Livin的降解，說明Livin的降解是通過泛素-蛋白酶體途徑介導并發(fā)生的。 同時我們也發(fā)現，RING結構域在Livin的自身泛素化過程中起了決定性的作用，而BIR結構域則表現出對其自身降解具有某種抑制作用。

4、 我們構建了幾個BIR結構域的點突變Cys124，Trp134，His144和RING區(qū)域的缺失突變，BIR結構域的突變大大增加了Livin的不穩(wěn)定性，而且突變后的Livin也不再能和Smac/DIABLO結合，從而導致其抗凋亡功能的減弱，而RING區(qū)域的缺失突變仍然可以和Smac/DIABLO結合。除泛素化降解機制外的其他的尚不可知的非泛素-蛋白酶體途徑依賴的機制可能參與了BIR結構域突變體的降解，從而使BIR點突變體表現出比野生

5、型Livin更加不穩(wěn)定。 我們的研究賦予Livin一個新的重要的功能：Livin可以通過泛素-蛋白酶體途徑來發(fā)揮E3泛素連接酶的功能促進促凋亡因子Smac/DIABLO的泛素化降解，從而在鬼臼乙叉甙誘導的細胞凋亡中更好的發(fā)揮其抑凋亡的功能。這為Livin發(fā)揮在細胞凋亡中的抑制作用尋找到了一條新的通路。 蛋白最先發(fā)現在細胞有絲分裂和細胞動力學的研究中，ARTS是特殊的隔蛋白，在活細胞中定位于線粒體中。ARTS最先出現在

6、TGF-β介導的凋亡通路中，現在發(fā)現ARTS在多種促凋亡的刺激因子如阿拉伯糖、鬼臼乙叉甙、星形孢菌素和Fas誘導的凋亡通路中起作用，并借助其P-loop結構域來介導凋亡。在凋亡刺激下，ARTS從線粒體中釋放出來，并通過和IAP家族成員XIAP結合并拮抗之而起到促凋亡的作用。ARTS和XIAP結合后使XIAP的蛋白質水平大大降低并激活半胱氨酸蛋白酶從而導致細胞凋亡。然而，ARTS是否能結合IAP家族的另一個成員Livin至今尚未有報道。而

7、且，在非凋亡的細胞中，ARTS通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導的蛋白質降解途徑保持在低的蛋白水平；當細胞發(fā)生凋亡時，ARTS穩(wěn)定、不再發(fā)生泛素化降解從而發(fā)揮其促凋亡的功能。但對于ARTS如何在這一系統(tǒng)中被調節(jié)尚未有系統(tǒng)的研究。 在本研究中，我們第一次通過實驗證實了ARTS可以和IAP家族的另一個成員Livin在凋亡的293T細胞和COS7細胞中結合，且這種結合是不依賴于ARTS羧基端的68個氨基酸、G3-loop區(qū)和其P-loop區(qū)

8、結構域，Livin的BIR和RING結構域對于它們的結合也是不必要的。 ARTS和Livin在非凋亡細胞中結合并定位在胞質中而在細胞凋亡的情況下結合且共定位在核中。 進一步的研究發(fā)現，Livin不能充當E3連接酶去泛素化降解ARTS，同時也驗證了凋亡細胞中ARTS不能發(fā)生泛素化降解。 我們也發(fā)現在凋亡細胞中、ARTS存在的情況下，Livin可以快且顯著的發(fā)生降解。Livin的這種降解通過泛素蛋白酶體的抑制劑