青蒿琥酯抗炎與抗菌增敏作用在其保護(hù)細(xì)菌膿毒癥模型小鼠中的作用及機制研究.pdf

1、目的： 膿毒癥(Sepsis)是由感染因素引起的全身失控性炎癥反應(yīng)綜合癥(Systemicinflammatoryresponsesydrome，SIRS)，由其導(dǎo)致的膿毒癥休克和多器官功能障礙綜合癥(multipleorgandysfuctionsyndrome，MODS)是死亡的重要原因，病死率高達(dá)50％-80％，至今尚無有效的治療手段。 目前認(rèn)為，菌體成分如細(xì)菌基因組DNA和存在于革蘭陰性細(xì)菌外膜的脂多糖/內(nèi)毒素(

2、lipopolysaccharide/endotoxin，LPS)等是誘導(dǎo)膿毒癥發(fā)生的主要致病因子。雖然抗菌藥物可抑制細(xì)菌的增殖，達(dá)到治療感染性疾病的目的，但已有大量實驗表明，許多抗菌藥物尤其是β-內(nèi)酰胺類抗生素在殺死細(xì)菌的同時，能促使內(nèi)毒素從細(xì)菌胞膜的釋放而加重感染。因此，尋找具有治療細(xì)菌膿毒癥的藥物對提高感染性疾病的治療效果具有重要意義。 我們實驗室前期的工作已證實：青蒿素對LPS、CpGODN、熱滅活大腸埃希菌攻擊小鼠具有

3、顯著的保護(hù)作用；其與β-內(nèi)酰胺類抗生素同時使用可對活大腸埃希菌攻擊小鼠具有顯著保護(hù)作用。但是，由于青蒿素不溶于水或油，僅能口服給藥，不適宜于重癥膿毒癥病人的搶救。 青蒿素的4種衍生物包括雙氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚及青蒿琥酯，均可靜脈、肌肉給藥，劑型適合重癥患者使用。鑒于與青蒿素相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，推測它們可能具有治療膿毒癥的效果。 為此，本課題擬通過體外細(xì)胞因子實驗篩選出對不同致炎成分誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放有較強抑制作用的青蒿素

4、衍生物；在上述工作基礎(chǔ)上，采用不同膿毒癥模型研究該青蒿素衍生物防治細(xì)菌膿毒癥的作用并探討其可能的作用機制，為尋找有效的治療細(xì)菌膿毒癥的藥物并拓寬青蒿素及其衍生物的臨床適應(yīng)癥提供實驗依據(jù)。 方法： 一、雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚抑制炎性細(xì)胞因子釋放的活性篩選：ELISA法觀察三種衍生物對不同刺激物誘導(dǎo)的小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞和傳代巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6的影響。 二、青蒿琥酯對細(xì)菌膿毒

5、癥模型小鼠的保護(hù)作用：分別建立熱滅活大腸埃希菌攻擊膿毒癥小鼠模型、活大腸埃希菌攻擊膿毒癥小鼠模型和CLP膿毒癥小鼠模型，觀察青蒿琥酯對不同膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用。 三、青蒿琥酯對細(xì)菌膿毒癥模型小鼠保護(hù)作用的分子機制研究。 (一)青蒿琥酯的抗炎作用分子機制研究。 1.生物傳感器技術(shù)研究青蒿琥酯與LPS/lipidA或CpGODN的直接結(jié)合作用； 2.鱟試劑動態(tài)濁度法檢測青蒿琥酯對內(nèi)毒素的體外中和作用；

6、 3.流式細(xì)胞術(shù)觀察青蒿琥酯對CpGODN在RAW264.7細(xì)胞表面結(jié)合及細(xì)胞內(nèi)聚集的影響： 4.RT-PCR觀察青蒿琥酯對TLR4mRNA、TLR9mRNA表達(dá)的影響；免疫熒光技術(shù)檢測青蒿琥酯對TLR9蛋白表達(dá)的影響； 5.ELISA法檢測青蒿琥酯對NF-κB活化的影響； (二)青蒿琥酯抗菌增敏作用及其機制研究。 1.采用微孔稀釋法觀察青蒿琥酯和不同抗菌藥物的MIC、青蒿琥酯和不同抗菌藥物聯(lián)合使用時

7、對大腸埃希菌國際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35218和臨床分離株MICs的影響； 2.采用動態(tài)生長曲線法觀察青蒿琥酯和不同抗菌藥物聯(lián)合使用時對大腸埃希菌ATCC35218和大腸埃希菌臨床分離株的體外協(xié)同抗菌作用； 3.采用激光共聚焦、熒光分光光度法觀察青蒿琥酯對柔紅霉素在大腸埃希菌ATCC35218內(nèi)聚集的影響； 4.透射電鏡技術(shù)觀察青蒿琥酯對大腸埃希菌ATCC35218胞膜通透性的影響。 結(jié)果： 一、雙氫青

8、蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚抑制炎性細(xì)胞因子釋放的活性篩選三種青蒿素衍生物中，青蒿琥酯抑制炎性細(xì)胞因子釋放的作用最強。 二、青蒿琥酯對細(xì)菌膿毒癥模型小鼠的保護(hù)作用。 1.青蒿琥酯能明顯延遲熱滅活大腸埃希菌攻擊模型小鼠的死亡時間，降低膿毒癥小鼠的死亡率，其保護(hù)作用可能與其降低熱滅活大腸埃希菌攻擊小鼠血清內(nèi)毒素和TNF-α的水平有關(guān)； 2.青蒿琥酯與慶大霉素、舒氨西林聯(lián)合使用對活大腸埃希菌攻擊膿毒癥模型小鼠具有協(xié)同保護(hù)作用

9、； 3.青蒿琥酯與舒氨西林聯(lián)合使用對CLP膿毒癥模型小鼠具有協(xié)同保護(hù)作用。 三、青蒿琥酯對膿毒癥模型小鼠保護(hù)作用的分子機制研究。 (一)青蒿琥酯的抗炎作用的機制研究。 1.青蒿琥酯在體外不能直接結(jié)合LPS和CpGODN，對LPS無中和作用； 2.青蒿琥酯對CpGODN表面的結(jié)合，但增加CpGODN在細(xì)胞內(nèi)的聚集； 3.青蒿琥酯可抑制熱滅活大腸埃希菌、LPS和CpGODN誘導(dǎo)的RAW264.

10、7細(xì)胞TLR4mRNA和TLR9mRNA高表達(dá)和TLR9蛋白的表達(dá)； 4.青蒿琥酯可抑制熱滅活大腸埃希菌誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB的活化。 (二)青蒿琥酯的抗菌增敏作用及機制研究。 1.青蒿琥酯單獨使用幾乎沒有抗菌作用，但與不同抗生素聯(lián)合使用時對大腸埃希菌可產(chǎn)生明顯的抗菌增敏作用； 2.青蒿琥酯可增加柔紅霉素在細(xì)菌內(nèi)聚集，呈顯著的量效和時效關(guān)系； 3.一定濃度的青蒿琥酯預(yù)處理可破壞大腸埃

11、希菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，其抗菌增敏作用機制可能與青蒿琥酯增加抗菌藥物在細(xì)菌內(nèi)的聚集有關(guān)。 結(jié)論： 1.雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚3種青蒿素衍生物中，青蒿琥酯抑制炎性細(xì)胞因子釋放的作用最強； 2.青蒿琥酯對熱滅活大腸埃希菌攻擊膿毒癥模型小鼠具有顯著的保護(hù)作用，青蒿琥酯與抗菌藥物聯(lián)合使用對活大腸埃希菌攻擊膿毒癥和CLP膿毒癥模型小鼠均具有協(xié)同保護(hù)作用； 3.青蒿琥酯的抗炎作用機制可能與抑制TLR4、TLR9