青蒿琥酯對急性胰腺炎動物模型的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見病，發(fā)病率高。由于急性胰腺炎發(fā)病急，病情發(fā)展快而復(fù)雜，可從最初的胰腺組織的局部病變迅速發(fā)展成為全身炎癥反應(yīng)綜合征(systematic inflammatory response syndrome，SIRS)、膿毒癥、膿毒癥休克乃至多器官功能衰竭，甚至死亡，治療非常棘手，雖然臨床采用綜合療法進(jìn)行治療，但效果并不滿意，總體死亡率仍然高達(dá)5％～13.6％

2、，因此研究新的有效藥物具有重要意義。
　　目的:
　　急性胰腺炎是由各種原因引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，膿毒癥是由感染因素導(dǎo)致的SIRS，又稱SIRS亞型。鑒于SIRS貫穿急性胰腺炎的病理生理過程，早期階段的SIRS如果得不到有效控制，晚期將出現(xiàn)膿毒癥、膿毒癥休克，發(fā)生多器官功能衰竭的風(fēng)險將大為增加，病死率也將增加4～5倍。因此，急性胰腺炎的本質(zhì)是SIRS和膿毒癥。
　　青蒿琥酯(artesunate，AS)為有效的抗瘧

3、藥物。前期我們課題組發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯可顯著提高膿毒癥模型動物的存活率，顯著降低模型小鼠體內(nèi)血清內(nèi)毒素、血清TNF-α、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的水平。鑒于急性胰腺炎的本質(zhì)是SIRS和膿毒癥，而青蒿琥酯具有良好的治療SIRS和膿毒癥作用，我們開展了青蒿琥酯治療AP的研究:在建立雨蛙素聯(lián)合脂多糖致AP小鼠模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行青蒿琥酯對急性胰腺炎模型小鼠的治療作用研究。
　　研究方法:
　　1.青蒿琥酯對急性胰腺炎模型小鼠的治療作用

4、r>　　(1)急性胰腺炎模型小鼠的制模方法
　　采用雨蛙素聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致小鼠急性胰腺炎模型:用劑量為100μg/kg的雨蛙素對小鼠進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)6次給藥，每次需間隔1小時，在最后一次注射雨蛙素后立即腹腔注射劑量為10 mg/kg的LPS，完成造模。
　　(2)青蒿琥酯對急性胰腺炎模型小鼠的治療作用
　　將60只昆明種小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和AS治療組，每組12只，其

5、中治療組為3個濃度(AS5.0 mg/kg，AS2.5 mg/kg，AS1.5 mg/kg)的AS組。
　　正常組小鼠給予生理鹽水;模型組小鼠在造模后，平行給予生理鹽水;治療組在造模完成后0小時和4小時肌肉注射不同濃度的青蒿琥酯。在造模完成后18小時，所有組別的小鼠采取眼眶取血，脫臼處死小鼠，留取胰腺組織，并進(jìn)行以下工作:①胰腺和周圍組織的大體形態(tài)學(xué)觀察;②胰腺組織病理學(xué)評分:取胰腺頭部進(jìn)行HE染色，鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)，并采用雙

6、盲法按Rongione法對胰腺組織病理學(xué)評分;③計算胰腺系數(shù):胰腺系數(shù)=胰腺濕重（毫克）/小鼠體重（克）;④組織、血清生化指標(biāo)檢測:用試劑盒測定胰腺組織中胰蛋白酶、脂肪酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量，以及血清淀粉酶(amylase，AMS)活力。采用軟件SPSS16.0對所測得的進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　2.青蒿琥酯對重癥急性胰腺炎模型

7、(SAP)大鼠的治療作用
　　(1)重癥急性胰腺炎模型大鼠模型的制作方法采用逆行性膽胰管注射3.5％牛黃膽酸鈉方法建立SAP大鼠模型。
　　(2)青蒿琥酯對重癥急性胰腺炎大鼠模型的治療作用。
　　將48只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、SAP模型組，AS治療組(5.00mg/kg，3.5mg/kg，1.75mg/kg，0.7mg/kg)和烏司他丁(US)組，每組6只。除正常組以外，各組采用逆行性膽胰管注射牛黃膽酸鈉方

8、法制作SAP大鼠模型后，4個AS組在0小時和4小時給予不同劑量的青蒿琥酯治療，連續(xù)三天給藥，每次間隔24小時。US組造模后平行給予烏司他丁制劑10000U/kg。正常組不給予任何操作，假手術(shù)組造模后平行給予生理鹽水。第三天給藥結(jié)束后，采用腹主動脈取血，同時摘取胰腺組織做病理學(xué)檢查、生存曲線及各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測，主要包括胰腺系數(shù)、組織脂肪酶活力和SOD活力、組織MDA含量，血清AMS活力等。
　　3.青蒿琥酯對急性胰腺炎治療作用的分子

9、機(jī)制研究
　　(1)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞分離和培養(yǎng)
　　采用膠原酶消化法分離SD大鼠原代胰腺腺泡細(xì)胞，將細(xì)胞分為正常組、脂多糖組、AS干預(yù)脂多糖組、AS組。脂多糖終濃度為1μg/mL，AS干預(yù)組先加入終濃度為10μg/mL的AS，2h后加入脂多糖孵育。加入脂多糖6h后進(jìn)行指標(biāo)檢測.
　　(2)各項(xiàng)指標(biāo)檢測
　?、賾?yīng)用半定量RT-PCR和ELISA法分別檢測AS處理對LPS誘導(dǎo)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞TNF-α、IL-1β、

10、IL-6mRNA表達(dá)及蛋白釋放的影響。
　?、趹?yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測大鼠胰腺腺泡細(xì)胞經(jīng)青蒿琥酯或LPS處理前后，其TLR2、TLR4和p65 mRNA表達(dá)的變化情況。
　　主要結(jié)果:
　　1.青蒿琥酯對重癥急性胰腺炎大鼠模型的治療作用
　　(1)胰腺組織觀察:不同劑量AS組小鼠和大鼠胰腺組較模型組血管充血情況減輕、出血點(diǎn)明顯減少，顏色接近正常組，胰腺系數(shù)較模型組有顯著降低。
　　(2)胰腺組織的病理

11、學(xué)評分:①AS組的胰腺組織較模型組在壞死、出血和炎性浸潤方面較模型組小鼠和大鼠有不同程度的減輕。②Rongione法病理學(xué)評分結(jié)果:治療組與模型組相比，胰腺損傷的組織病理學(xué)評分均降低，有顯著性差異（P＜0.05），各AS組間有一定的量-效關(guān)系趨勢，但各組間無顯著差異(P＞0.05）。
　　(3)組織、血清生化指標(biāo)檢測:
　?、俳M織脂肪酶、蛋白酶和SOD活力、MDA含量測定:與正常組比較，模型組小鼠組織胰脂肪酶、胰蛋白酶活力和

12、MDA含量有顯著增加(P＜0.01），AS組與模型組比較，其各項(xiàng)指標(biāo)都有降低(P＜0.05），各AS組間有一定的量-效關(guān)系趨勢，但各組間無顯著差異(P＞0.05)。同時與模型組比較，AS組的SOD活力有明顯升高。②模型組的AMS活力較正常組明顯升高，而AS各組較模型組有明顯降低。
　　2.青蒿琥酯對重癥急性胰腺炎大鼠模型治療作用的機(jī)制研究。
　　(1)青蒿琥酯能夠抑制由LPS誘導(dǎo)的促炎性因子IL-1β和IL-6的分泌。

13、>　　(2)青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的急性胰腺炎大鼠胰腺細(xì)胞的TLR2、TLR4和p65的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.青蒿琥酯能明顯改善急性胰腺炎模型小鼠胰腺組織的病變情況，可顯著降低其血清淀粉酶、胰腺組織脂肪酶和蛋白酶的活力，增加組織的SOD活力以及降低組織MDA含量。
　　2.青蒿琥酯能明顯改善重癥急性胰腺炎模型大鼠胰腺組織的病變情況，可顯著降低其血清淀粉酶、胰腺組織脂肪酶的活力，增加組織的SOD活力以