青蒿琥酯增強β-內(nèi)酰胺類抗生素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)膿毒癥模型小鼠的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　 膿毒癥(Sepsis)是由感染因素引起的全身失控性炎癥反應(yīng)綜合癥(Systemicinflammatory response syndrome, SIRS)，膿毒癥休克和多器官功能障礙綜合癥(multipleorgan dysfunction syndrome, MODS)是死亡的重要原因，病死率高達50％-80％，至今尚無有效的治療手段。革蘭陽性細菌可以通過其細菌本身及菌體成分，如肽聚糖、磷壁酸等，刺激機體導(dǎo)致感

2、染性休克。由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）導(dǎo)致的膿毒癥由于其對多種抗生素的耐藥，因此表現(xiàn)出相較于甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）導(dǎo)致的膿毒癥更差的預(yù)后，最終可導(dǎo)致膿毒癥休克及死亡。
　　 在MRSA 膿毒癥治療中我們不僅僅要控制MRSA細菌的繁

3、殖，也要控制細菌感染所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。然而在現(xiàn)有的臨床治療中，針對膿毒癥的藥物只有重組人活化C蛋白(recombinant human activated protein C，rhAPC)，但是現(xiàn)在它的療效也被質(zhì)疑。
　　 若能尋找到既可以克服MRSA 耐藥，又可以有效控制膿毒癥的藥物具有重大的意義。
　　 MRSA作為一種“超級細菌”，對大量的抗菌藥物都表現(xiàn)為耐藥，只對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺等少數(shù)抗菌藥物有效。M

4、RSA對β-內(nèi)酰胺類抗生素的最主要耐藥機制：一是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，β-內(nèi)酰胺酶利用其活性位點的絲氨酸水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，水解β-內(nèi)酰胺類抗生素而致耐藥；二是減少菌體內(nèi)藥物的含量，包括增加細菌外膜通透性或抑制細菌的主動外排系統(tǒng)；三是大量表達特殊的青霉素結(jié)合蛋白------PBP2a。
　　 其中以mecA基因及其表達的PBP2a蛋白為靶點著手尋找控制MRSA的方法是目前科學(xué)家們研究的焦點與熱點。但迄今為止，以PBP2a為靶點研究的藥

5、物尚未獲得成功。
　　 在金黃色葡萄球菌中，研究者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過10種以上的外排泵，如NorA, NorB,NorC、MdeA、MepA、QacA/B等。大部分的外排泵均屬于主要易化子超家族，包括染色體編碼的的外排泵NorA、NorB、NorC等，及質(zhì)粒編碼的外排泵QacA/B等。此外還有其他種類的外排泵也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如MepA 屬于多藥和毒物排出家族，Smr 屬于小多重耐藥家族。盡管這些外排泵的底物各不相同，但是他們中大多數(shù)

6、的底物都屬于不同的類別，因此都可以導(dǎo)致細菌表現(xiàn)為多重耐藥。
　　 大量前炎癥因子的釋放是膿毒癥的特征之一，TNF-α為早期前炎癥細胞因子之一，而IL-6是晚期前炎癥因子之一。革蘭陽性細菌的菌體成分如肽聚糖，磷壁酸可以通過TLR2(Toll-like receptor 2)和NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain containing2)途徑介導(dǎo)的信號通路，誘導(dǎo)這些前炎癥細胞

7、因子的釋放。細菌的大量繁殖可以導(dǎo)致持續(xù)的前炎癥細胞因子的釋放，最終導(dǎo)致失控性膿毒癥甚至膿毒癥性休克。
　　 MRSA是臨床超級耐藥菌治療棘手，而青蒿琥酯不僅能夠增強現(xiàn)有抗菌藥物的抗MRSA 活性，而且還具有抗炎活性。因此在本項目中我們希望通過青蒿琥酯對MRSA膿毒癥治療作用及作用機制的深入研究，為青蒿琥酯的老藥新用、以及對其結(jié)構(gòu)改造得到更高抗菌增敏作用及抗炎作用的衍生物奠定實驗基礎(chǔ)?；谏鲜鰧嶒灲Y(jié)果與分析，本課題將MRSA 膿毒

8、癥作為研究對象，在體內(nèi)外研究青蒿琥酯增強β-內(nèi)酰胺類抗生素對MRSA 膿毒癥小鼠的保護作用及其可能機制。
　　 方法：
　　 1.青蒿琥酯聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗生素對MRSA 膿毒癥模型小鼠的保護作用1.1建立致死劑量WHO-2 膿毒癥小鼠模型，觀察青蒿琥酯聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗生素對模型小鼠的死亡率的影響；
　　 1.2. 建立亞致死劑量WHO-2 膿毒癥小鼠模型，觀察青蒿琥酯聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗生素對模型小鼠血中細菌數(shù)

9、量及前炎癥細胞因子釋放的影響。
　　 2.青蒿琥酯增強β-內(nèi)酰胺類抗生素抗MRSA的作用及分子機制研究2.1. 微孔稀釋法觀察青蒿琥酯和β-內(nèi)酰胺類抗生素對WHO-2和臨床分離株的MIC、青蒿琥酯和β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用對WHO-2和臨床分離株MICs 生長的影響；動態(tài)生長曲線法觀察青蒿琥酯和β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用對WHO-2的體外協(xié)同抗菌作用；
　　 2.2. 動態(tài)生長曲線法觀察青蒿琥酯抗菌增敏作用與β-內(nèi)酰胺

10、酶的關(guān)系；
　　 2.3. 生物傳感器技術(shù)觀察青蒿琥酯與PBP2a的親和力；Realtime PCR 技術(shù)觀察青蒿琥酯對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素誘導(dǎo)后WHO-2菌mecA基因表達的影響；
　　 2.4. 激光共聚焦、熒光分光光度法觀察青蒿琥酯對柔紅霉素在WHO-2內(nèi)聚集的影響；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)觀察青蒿琥酯對苯唑西林在WHO-2內(nèi)聚集的影響；透射電鏡技術(shù)觀察青蒿琥酯對WHO-2菌胞壁通透性的影響；Realtime PCR 技術(shù)觀察

11、青蒿琥酯對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素刺激后WHO-2菌外排泵基因表達的影響。
　　 3.青蒿琥酯抗炎作用及分子機制研究3.1. ELISA 法檢測青蒿琥酯對熱滅活WHO-2 誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6的影響；
　　 3.2. Realtime-PCR 法及Western-blot 法觀察青蒿琥酯對熱滅活WHO-2 誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞TLR2、NOD2 Mrna及蛋白表達的影響；ELISA 法檢測青蒿琥酯

12、對熱滅活WHO-2 誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞NF-κ B 活化的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.青蒿琥酯聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗生對MRSA 膿毒癥模型小鼠的保護作用1.1. 青蒿琥酯能明顯增強β-內(nèi)酰胺類抗生素對WHO-2 膿毒癥模型小鼠的保護作用；
　　 1.2. 青蒿琥酯聯(lián)合β-內(nèi)酰胺類抗生素能明顯降低WHO-2 膿毒癥模型小鼠血中細菌水平及血漿TNF-α和IL-6水平，效果強于單獨使用β-內(nèi)酰胺類抗生素。

13、　　 2.青蒿琥酯增強β-內(nèi)酰胺類抗生素抗MRSA的作用及分子機制研究2.1. 青蒿琥酯能明顯降低WHO-2和MRSA 臨床分離株對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性；
　　 2.2. 青蒿琥酯抗菌增敏作用與β-內(nèi)酰胺酶無關(guān)；
　　 2.3. 青蒿琥酯與PBP2a 具有直接結(jié)合作用，并且親和力高于其他的抗菌藥物；青蒿琥酯對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素誘導(dǎo)后WHO-2菌mecA基因的高表達具有抑制作用；
　　 2.4. 青蒿琥酯

14、可增加柔紅霉素和苯唑西林在WHO-2內(nèi)聚集；抗菌增敏濃度下青蒿琥酯不破壞WHO-2細胞壁結(jié)構(gòu)；青蒿琥酯對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素誘導(dǎo)后WHO-2菌部分外排泵基因表達升高具有抑制作用。
　　 3.青蒿琥酯的抗炎作用及分子機制研究3.1. 青蒿琥酯對熱滅活WHO-2 誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6 具有抑制作用；
　　 3.2. 青蒿琥酯對熱滅活WHO-2 誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞TLR2、NOD2 Mrna及蛋白

15、表達及NF-κ B 活化具有抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 1．青蒿琥酯能明顯增強β-內(nèi)酰胺類抗生素對MRSA 膿毒癥模型小鼠的保護作用；
　　 該作用與其增強抗生素降低MRSA 膿毒癥模型小鼠血中細菌水平和炎性細胞因子水平相關(guān)；
　　 2．青蒿琥酯對β-內(nèi)酰胺類抗生素抗MRSA 具有增敏作用，該作用與其抑制mecA基因的表達，或直接結(jié)合PBP2a 有一定關(guān)系；也可能與其增加MRSA細菌內(nèi)藥物的聚集有關(guān)，