抗LAG-3抗體對(duì)膿毒癥小鼠保護(hù)作用及免疫功能影響的研究.pdf

1、目的:
　　 膿毒癥(sepsis)是指由于創(chuàng)傷、感染等一系列因素引起機(jī)體過(guò)激的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，繼而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重危害的疾病，其病死率一直居高不下。膿毒癥病理生理過(guò)程中免疫系統(tǒng)的功能抑制是其中的一個(gè)非常突出問(wèn)題，并已經(jīng)成為膿毒癥病死率居高不下以及各種治療效果不佳的重要原因。而在導(dǎo)致免疫抑制的各種原因中，淋巴細(xì)胞的凋亡以及功能障礙是一個(gè)重要的原因，但是其具體發(fā)生機(jī)制目前尚未完全清楚。
　　 淋巴細(xì)胞活化基因-3分子(l

2、ymphocyteactivationgene3，LAG-3，CD223)是免疫球蛋白超家族的一員，可負(fù)性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的各項(xiàng)功能和生存周期。已有研究表明，LAG-3在病毒感染、自身免疫疾病以及腫瘤所致的免疫系統(tǒng)功能紊亂中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)影響LAG-3的功能可以改善這些疾病演進(jìn)過(guò)程中免疫功能失常狀態(tài)，從而改善疾病的預(yù)后。
　　 LAG-3分子在膿毒癥免疫抑制中扮演何種作用，干預(yù)LAG-3分子能否影響膿毒癥的預(yù)后和免疫系統(tǒng)功能尚

3、未見(jiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究盲腸結(jié)扎穿孔(cecalligationandpuncture，CLP)膿毒癥后LAG-3分子在小鼠不同免疫細(xì)胞上的表達(dá)變化；并探索應(yīng)用抗LAG-3抗體治療后，是否對(duì)膿毒癥小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用，是否會(huì)影響淋巴細(xì)胞凋亡及功能，并以此探求其在膿毒癥免疫抑制中的作用，以及膿毒癥免疫治療合理可靠的治療靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1、采用CLP術(shù)致膿毒癥小鼠模型。將24只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組

4、(n=10)和CLP組(n=14)，手術(shù)24h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)CLP組和假手術(shù)組小鼠外周血CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞、自然殺傷(naturalkiller，NK)細(xì)胞、脾臟CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatoryTcells，Treg)、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)上的LAG-3表達(dá)水平。
　　 2、將81只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham，n=9)

5、、CLP組(CLP，n=16)、CLP+腹腔注射抗LAG-3抗體組(i.p.Anti-LAG-3，n=16)、CLP+腹腔注射同型對(duì)照抗體組(i.p.Isotype，n=12)、CLP+尾靜脈注射抗LAG-3抗體組(i.v.Anti-LAG-3，n=16)和CLP+尾靜脈注射同型對(duì)照抗體組(i.v.Isotype，n=12)，手術(shù)后3h給予抗LAG-3抗體或同型對(duì)照抗體(均每只50μg/200μl)，觀察抗體干預(yù)后小鼠10d生存率及生存

6、時(shí)間。
　　 3、將55只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham，n=7)、CLP組(CLP，n=18)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3，n=18)、同型對(duì)照抗體組(Isotype，n=12)，除假手術(shù)組外其余小鼠均行CLP術(shù)，并于手術(shù)后3h按分組分別經(jīng)腹腔給予抗LAG-3抗體或同型對(duì)照抗體(均每只50μg/200μl)。24h后取各組小鼠肺組織、外周血及腹腔沖洗液，檢測(cè)肺組織濕重/干重比值，血液及腹腔沖洗液細(xì)菌

7、負(fù)荷，以及血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平。
　　 4、將33只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham，n=8)、CLP組(CLP，n=9)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3，n=9)、同型對(duì)照抗體組(Isotype，n=7)，除假手術(shù)組外其余小鼠均行CLP術(shù)，并于手術(shù)后3h按分組分別經(jīng)腹腔給予抗LAG-3抗體或同型對(duì)照抗體(均每只50μg/200μl)。24h后取各組小鼠外周血、脾臟及胸腺，采用流式細(xì)胞儀

8、檢測(cè)各組小鼠外周血及脾臟CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)檢測(cè)小鼠胸腺T淋巴細(xì)胞凋亡情況。另取同樣分組及同樣處理的18只C57BL/6小鼠脾臟及胸腺，采用TUNEL法檢測(cè)其凋亡情況。
　　 5、取CLP術(shù)后18h小鼠脾臟，采用密度梯度法分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，之后將分離得到的細(xì)胞分為兩部分，每部分設(shè)立對(duì)照組(Control)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3)和同型對(duì)照抗體組(Isotype)。一部分以抗CD3/抗

9、CD28抗體培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，72h后收集細(xì)胞檢測(cè)；另一部分用重組小鼠TNF-α培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，18h后收集細(xì)胞檢測(cè)。均采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞的凋亡情況。
　　 6、取CLP術(shù)后18h小鼠脾臟，采用密度梯度法分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，之后將分離得到的細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3)和同型對(duì)照抗體組(Isotype)，先以抗CD3/抗CD28誘導(dǎo)刺激細(xì)

10、胞生長(zhǎng)67h，再采用PMA、離子霉素和BFA共同刺激細(xì)胞分泌細(xì)胞因子5h，之后收集細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)分泌IFN-γ的水平。
　　 7、取CLP術(shù)后18h小鼠脾臟，采用密度梯度法分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，之后將分離得到的細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3)和同型對(duì)照抗體組(Isotype)，先用CFSE標(biāo)記細(xì)胞，后加入抗CD3/抗CD28抗體培

11、養(yǎng)刺激細(xì)胞增殖，5d后收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、CLP術(shù)后24h時(shí)，膿毒癥小鼠外周血CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞和NK細(xì)胞表面LAG-3表達(dá)較假手術(shù)組均非常顯著升高(P均小于0.01)；脾臟CD4+CD25+Treg、DC的表面的LAG-3表達(dá)較假手術(shù)組也均非常顯著升高(P均小于0.01)。
　　 2、C

12、LP術(shù)后3h給予抗LAG-3抗體，i.p.Anti-LAG-3組和i.v.Anti-LAG-3組小鼠生存率及生存時(shí)間顯著高于CLP組、i.P.Isotype組和i.v.Isotype組(P均小于0.05)。而i.p.Anti-LAG-3組和i.v.Anti-LAG-3組之間，以及i.p.Isotype組和i.v。Isotype組之間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均大予0.05)。
　　 3、體內(nèi)研究結(jié)果表明，Anti-LAG-3組小鼠肺

13、組織濕重/干重比值顯著低于CLP組及Isotype組(P均小于0.01)。此外，培養(yǎng)Anti-LAG-3組小鼠血液和腹腔灌洗液，其細(xì)菌菌落數(shù)均顯著低于CLP組及Isotype組(P均小于0.01)。促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6還是抗炎細(xì)胞因子IL-10,Anti-LAG-3組均顯著低于CLP組及Isotype組(P均小于0.01)。
　　 4、體內(nèi)研究結(jié)果表明，Anti-LAG-3組小鼠外周血及脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8

14、+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于CLP組和Isotype組(P均小于0.05)。Anti-LAG-3組小鼠胸腺CD3+細(xì)胞及CD3-細(xì)胞凋亡比例均顯著低于CLP組及Isotype組(P均小于0.05)。TUNEL結(jié)果顯示，Anti-LAG-3組小鼠胸腺及脾臟組織中TUNEL染色陽(yáng)性的細(xì)胞比例均顯著低于CLP組和Isotype組(P均小于0.01)。
　　 5、體外抗CD3/抗CD28抗體誘導(dǎo)CLP小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡后顯示，Anti-

15、LAG-3組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞凋亡比例顯著低于Control組和Isotype組(P均小于0.01)。而采用TNF-α誘導(dǎo)凋亡后CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡比例無(wú)差異(P均大于0.05)。
　　 6、體外刺激CLP小鼠脾臟淋巴細(xì)胞后顯示，Anti-LAG-3組IFN-γ+的CD4+T淋巴細(xì)胞比例顯著高于Control組及Isotype組(P均小于0.01)。而各組IFN-γ+的CD8+T淋巴細(xì)胞比例差異

16、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均大于0.05)。
　　 7、體外檢測(cè)CLP小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖情況表明，Anti-LAG-3組CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞增殖比例均明顯高于Control組及Isotype組(P均小于0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 CLP致膿毒癥小鼠外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞、NK細(xì)胞、脾臟Treg細(xì)胞、DC上的LAG-3表達(dá)水平均明顯升高。應(yīng)用抗LAG-3抗體之后，可

17、以明顯延長(zhǎng)CLP小鼠的生存率和生存時(shí)間，且無(wú)論經(jīng)腹腔還是經(jīng)靜脈用藥均有效，兩種給藥方式之間無(wú)差異。在體應(yīng)用抗LAG-3抗體之后，對(duì)CLP小鼠起到了明顯的保護(hù)作用，表現(xiàn)在肺組織濕重/干重比值降低，血液和腹腔細(xì)菌負(fù)荷明顯減輕，血漿促炎和抗炎細(xì)胞因子水平下降。在免疫細(xì)胞功能方面，本研究結(jié)果提示：①在體應(yīng)用抗LAG-3抗體后CLP膿毒癥小鼠外周血和脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞，胸腺各發(fā)育階段細(xì)胞凋亡均有明顯減少，TUNEL結(jié)果也提

18、示CLP膿毒癥小鼠胸腺和脾臟凋亡情況有所減輕；②體外研究結(jié)果提示，抗LAG-3抗體主要參與保護(hù)了T淋巴細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)途徑而非TNF-α-TNFR途徑誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞凋亡；③體外應(yīng)用抗LAG-3抗體后，抗LAG-3抗體可以促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞分泌WN-γ，向具有促進(jìn)細(xì)胞免疫效應(yīng)的1型輔助性T細(xì)胞(Thelpercell1，Th1)方向分化，但對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子方面無(wú)明顯改善作用；④體外應(yīng)