菜籽多糖的提取、分離純化及其對(duì)益生菌的增殖作用研究.pdf

1、本文研究了菜籽多糖的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)及其對(duì)腸道益生菌的體外增殖作用。首先，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析研究了菜籽多糖的氫氧化鈉堿法提取最佳工藝條件。然后，依次通過(guò)膜分離脫蛋白、大孔樹(shù)脂脫色、DEAE-纖維素和SephadexG-100柱層析分離純化得到兩個(gè)多糖組分(RP1和RP2)。分析了RP1和RP2的化學(xué)組成和基本結(jié)構(gòu)，并考察了其對(duì)模擬胃液和α-淀粉酶的抗消化性，以及對(duì)腸道益生菌的體外增殖作用。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　

2、1、菜籽多糖的堿法提取工藝研究。首先以NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間和液料比為因素，以菜籽多糖得率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定以上四個(gè)因素對(duì)菜籽多糖得率的影響。在此基礎(chǔ)上，選取NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間為自變量，以多糖得率為響應(yīng)值，通過(guò)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，優(yōu)化了菜籽多糖的堿法提取工藝，得到二次多項(xiàng)式方程的預(yù)測(cè)模型，確定了菜籽多糖的最佳提取工藝條件，即：NaOH濃度4.1%，提取溫度86℃，提取時(shí)間3h

3、，液料比25:1，在此條件下多糖得率達(dá)到5.86%。
　　2、菜籽多糖的分離純化工藝研究。菜籽經(jīng)過(guò)粉碎、去皮、脫脂、脫色素等預(yù)處理后，用氫氧化鈉溶液浸提，然后通過(guò)膜分離脫蛋白、大孔樹(shù)脂脫色、濃縮、乙醇沉淀、離心、冷凍干燥得到菜籽粗多糖。粗多糖通過(guò)DEAE-纖維素柱層析分級(jí)，依次用蒸餾水和0.05、0.10、0.20mol/LNaCl溶液洗脫，收集由蒸餾水和0.10mol/LNaCl溶液洗脫的組分，經(jīng)過(guò)透析、濃縮和冷凍干燥后，再經(jīng)過(guò)

4、SephadexG-100層析柱進(jìn)一步分離純化，最后得到兩個(gè)多糖組分RP1和RP2。在脫蛋白處理中，比較了500kDa膜分離和Sevag法對(duì)菜籽多糖的蛋白去除率和多糖保留率的影響，結(jié)果表明膜分離法有較高的蛋白去除率和多糖保留率。脫色研究中，大孔樹(shù)脂AB-8和D101的脫色效果比較表明，AB-8和D101的脫色率和多糖保留率都達(dá)到80%以上，但綜合考慮脫色率和多糖保留率，AB-8要稍微優(yōu)于D101。
　　3、菜籽多糖的化學(xué)組成和基本

5、結(jié)構(gòu)研究。測(cè)定結(jié)果顯示RP1中總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸和硫酸根含量分別為68.25%、13.26%、8.84%及9.65%，其蛋白質(zhì)部分由14種氨基酸組成；RP2中總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸和硫酸根含量分別為65.86%、19.10%、4.89%及10.15%，其蛋白質(zhì)部分由13種氨基酸組成；HPLC分析表明RP1和RP2都是均一的多糖組分，平均分子量分別為28.51kDa和6.55kDa；GC分析表明RP1是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡

6、萄糖和半乳糖6種單糖組成，其摩爾百分含量分別為2.45%、21.47%、4.28%、8.79%、59.81%和3.20%。RP2也是由以上六種單糖組成，其摩爾百分含量分別為1.30%、56.23%、5.52%、26.83%、6.81%和3.31%；紫外掃描結(jié)果顯示兩種組分不含核酸，含有蛋白質(zhì)；紅外光譜分析表明，RP1和RP2都具有多糖的特征吸收峰，并且都含有羰基和N-H鍵，表明兩者都是多糖-蛋白綴合物。
　　4、菜籽多糖對(duì)模擬胃液

7、和α-淀粉酶的抗消化性研究。以低聚果糖(FOS)為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)測(cè)定RP1和RP2在不同pH的模擬胃液和α-淀粉酶中的水解度，考察菜籽多糖的體外抗消化性。結(jié)果表明RP1和RP2在pH1～5的模擬胃液中水解6h后最大水解度分別為2.78%和4.02%，在pH5～8的α-淀粉酶中水解6h后最大水解度分別為5.07%和8.06%，表明兩者能夠較好地抵抗胃酸和α-淀粉酶的水解，不容易被上消化道消化，初步符合益生元的標(biāo)準(zhǔn)。
　　5、菜籽多糖

8、對(duì)腸道益生菌的體外增殖作用研究。在無(wú)碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入不同濃度的菜籽粗多糖(CRP)、RP1和RP2，以空白和低聚果糖(FOS)為對(duì)照，接種不同益生菌后進(jìn)行體外厭氧培養(yǎng)。在培養(yǎng)0h和48h后，測(cè)定培養(yǎng)基中的活菌數(shù)和pH。結(jié)果表明菜籽粗多糖、RP1、RP2對(duì)青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacter

9、iumbifidum)和嗜酸乳桿菌(Lacrobacillusacidophilus)均有顯著的促進(jìn)增殖的作用。在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基的pH相應(yīng)降低，說(shuō)明菜籽多糖可以被益生菌利用，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)。但是經(jīng)過(guò)分離純化后的菜籽多糖RP1和RP2對(duì)益生菌的增殖效果比菜籽粗多糖顯著，而且RP1的效果優(yōu)于RP2。另外，多糖的濃度對(duì)于益生菌的增殖作用有影響，多糖的最佳濃度是2.0～3.0%。通過(guò)比濁法考察了RP1和RP2對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)速率