鈣轉(zhuǎn)運異常與高尿酸導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞損傷的相關(guān)關(guān)系及其分子機制研究.pdf

1、研究背景：隨著我國社會的進步，居民蛋白攝入和果糖攝入的增多，高尿酸血癥已經(jīng)成為危害我國居民健康的一個重要的危險因素。隨著研究的深入，學(xué)術(shù)界逐漸認識到，高尿酸（Uric acid，UA）導(dǎo)致的危害并不僅僅限于其能夠?qū)е峦达L(fēng)、泌尿系統(tǒng)結(jié)石和傳統(tǒng)意義上的“尿酸性腎病”，人們發(fā)現(xiàn)，高UA本身就能夠?qū)е滦难芟到y(tǒng)和腎小球的損傷。其中高UA導(dǎo)致的內(nèi)皮功能損傷和炎癥反應(yīng)起著重要的作用。目前認為，細胞內(nèi)線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致的線粒體功能損傷是內(nèi)皮細胞損傷

2、的主要機制之一，線粒體功能異常會直接導(dǎo)致細胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加，同時還會抑制內(nèi)皮細胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的產(chǎn)生以及一氧化氮（NO）的釋放，此外還會導(dǎo)致細胞炎癥因子產(chǎn)生的增多。因此，我們認為在高UA導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷過程中，可能也遵從這一途徑，或者可能還有其他的特殊機制。這是本研究的出發(fā)點。
　　 目的：探討高UA導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)過程中細胞內(nèi)鈣啟動機制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞系（HU

3、VEC-C），分別給予不同濃度和不同時間點的UA刺激。在本研究的第一部分，即UA刺激HUVEC-C后內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)的現(xiàn)象研究中，針對細胞內(nèi)不同部位的鈣離子濃度，我們分別使用細胞胞漿鈣離子（[Ca2+]cyt）的特異性探針Fluo-3 AM和線粒體鈣離子（[Ca2+]mito）的特異性探針Rhod-2AM，對活細胞進行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)鈣離子的改變情況：針對細胞內(nèi)的超氧陰離子（·O2-），我們使用細胞內(nèi)總·O2-的特異性

4、探針CM-H2DCFDA檢測高UA刺激后的趨勢，使用專門針對定位于線粒體·O2-的特異性探針--感染攜帶黃色熒光蛋白（cpYFP）的腺病毒的方法--檢測線粒體內(nèi)·O2-的變化：針對內(nèi)皮損傷和炎癥。我們使用硝酸還原酶法檢測內(nèi)皮細胞釋放NO的改變趨勢，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、Western Blot以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等方法分別檢測eNOS以及一系列炎癥因子如C-反應(yīng)蛋白（CRP）、細胞間粘附分子-1（ICAM-1

5、）和白介素-6（IL-6）在mRNA和蛋白水平表達的變化情況。在本研究的第二部分，即機制研究中，我們分別使用了一些常見的細胞內(nèi)鈣通道的特異性阻斷劑，如細胞膜L型鈣通道阻斷劑Nicardipine，細胞膜鈉鈣交換體（NCXpm）的阻斷劑KB-R7943；定位于線粒體的鈣單向轉(zhuǎn)運體（MCU）的阻斷劑Ru360，線粒體鈉鈣交換體（NCXmito）的阻斷劑CGP-37157；定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶（SERCA）的阻斷劑T

6、hapsigangin，1，4，5-三磷酸肌醇受體（IP3R）的阻斷劑2APB以及Ryanodine受體的阻斷劑Ryanodine（大劑量），阻斷各自的鈣通道，然后觀察高UA刺激內(nèi)皮細胞后內(nèi)皮功能的變化以及炎癥反應(yīng)的改變趨勢。
　　 結(jié)果：高UA可呈時間、濃度依賴性地導(dǎo)致內(nèi)皮損傷，表現(xiàn)為eNOS產(chǎn)生和NO釋放的減少，預(yù)先使用ROS的清除劑維生素C（Vit C）有助于減輕其內(nèi)皮損傷：在此過程中，[Ca2+]mito顯著升高，而[C

7、a2+]cyt未出現(xiàn)顯著變化；同時，內(nèi)皮細胞產(chǎn)生·O2-顯著增多，炎癥因子釋放明顯增多。當(dāng)阻斷位于ER的IP3R和位于線粒體的NCXmito時，UA導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞[Ca2+]mito，總·O2-水平和線粒體·O2-水平均明顯緩解，同時NO釋放的降低會得到恢復(fù)，炎癥因子的產(chǎn)生增多顯著下降；而阻斷SERCA和MCU則只能降低[Ca2+]mito和總·O2-水平的增加，無助于減少線粒體·O2-，也無減輕內(nèi)皮損傷和炎癥反應(yīng)的作用。L型通道的阻斷

8、刺Nicardipine雖然不能減輕[Ca2+]mito，總·O2-水平和線粒體·O2-水平的增加，卻能在一定程度上減輕內(nèi)皮損傷和炎癥。
　　 結(jié)論：UA導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞損傷和炎癥反應(yīng)過程中，細胞內(nèi)鈣的變化，尤其是[Ca2+]mito的增多（線柱體鈣超載）起著啟動作用：ROS，尤其是·O2-的增多在此過程中起重要的介導(dǎo)作用；鈣在IP3R和NCXmito兩個通道的轉(zhuǎn)運可能在此過程中起著重要的作用。本研究的結(jié)果揭示了UA導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的