先天性心臟病血漿microRNA表達(dá)譜及與GATA4靶序列單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究目的：
　　1.篩選并驗(yàn)證室間隔缺損患者血漿中表達(dá)差異的micmRNA;評(píng)價(jià)血漿microRNA在先心病早期診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值以及作為先心病分子診斷標(biāo)志物的可行性，建立臨床早期診斷模型。
　　2.結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測以及功能注釋和pathway注釋，構(gòu)建microRNA與基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò);篩選先心病相關(guān)基因的microRNA靶序列中功能性SNPs及其參與調(diào)控的microRNA，為開

2、展系統(tǒng)性的microRNA靶序列與先心病的關(guān)聯(lián)研究以及機(jī)制分析提供參考。
　　3.研究GATA4基因3'UTR靶序列的8個(gè)功能性SNPs與先心病人群易感性的關(guān)聯(lián);采用熒光素酶報(bào)告基因功能實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)SNP rs3203358影響miR-583對GATA4基因的結(jié)合和表達(dá)調(diào)控，分析多態(tài)介導(dǎo)的microRNA調(diào)控靶基因引起先心病發(fā)生的可能機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.研究對象
　　采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對照研究方法開

3、展本次研究，設(shè)計(jì)合理對照組進(jìn)行試驗(yàn)。
　　2.樣本采集
　　于入院次日清晨空腹采集研究對象靜脈血標(biāo)本4ml，進(jìn)行適當(dāng)處理。
　　3.microRNA全基因組表達(dá)譜芯片篩選
　　采用7th generation of miRCURYTM LNA Array全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)，對樣本進(jìn)行microRNA芯片檢測。應(yīng)用GenePix Pro6.0 software分析表達(dá)譜芯片結(jié)果。
　　4.實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)

4、證
　　抽提血漿總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA后，以miR-93為內(nèi)參照，各樣品的目的microRNA和內(nèi)參分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。
　　5.診斷模型的建立和評(píng)價(jià)
　　選擇8個(gè)重要差異表達(dá)的microRNA，利用124例樣本的RT-PCR檢測數(shù)據(jù)對比表達(dá)差異獲得具有臨床診斷意義的血漿microRNA，建立多指標(biāo)的logistic回歸模型。
　　6.靶基因分析和靶序列SNP

5、s篩選
　　運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法對microRNA差異表達(dá)譜進(jìn)行靶基因預(yù)測、聚類分析。
　　7.GATA4基因3'UTR區(qū)域靶序列SNPs檢測
　　利用Sanger雙脫氧氫測序技術(shù)對GATA4基因3'UTR區(qū)域8個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行病例組和對照組的基因型檢測。并進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。
　　研究結(jié)果：
　　1.先心病患者血漿差異microRNAs篩選及驗(yàn)證
　　利用miRCURYTM LNA Ar

6、raymicroRNA芯片技術(shù)檢測了3例室間隔缺損患者和3例健康對照血漿中的microRNA表達(dá)特征，初步確定了VSD差異microRNA表達(dá)譜。芯片雜交初篩結(jié)果顯示:與對照組相比，有36個(gè)表達(dá)差異的microRNA(P＜0.05)，其中21個(gè)microRNA在VSD患者表達(dá)顯著下調(diào)，表達(dá)顯著上調(diào)的microRNA有15個(gè)。選擇出8個(gè)重要的差異表達(dá)microRNA進(jìn)行隨后的兩階段大樣本qRT-PCR驗(yàn)證，檢測到5種血漿microRNA在

7、VSD中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以選擇作為具有VSD早期診斷意義的生物標(biāo)志物。
　　2.先心病血漿microRNA診斷模型及其評(píng)價(jià)
　　采用ROC曲線分析5種血漿microRNA表達(dá)水平對于VSD的診斷效率。上述5種血漿microRNA的ROC曲線下面積分別在0.678至0.832之間，其中miR-222-3p的ROC曲線下面積最大為0.7832。建立多指標(biāo)Logistic回歸分析模型，5種血漿microRNAs聯(lián)合模型

8、可提高VSD的診斷效率，ROC曲線下面積達(dá)到0.953，靈敏度及特異度分別為0.839和0.952;3種血漿microRNA聯(lián)合診斷模型，ROC曲線下面積達(dá)到0.910，靈敏度及特異度分別為0.823和0.903。
　　3.差異microRNAs靶基因預(yù)測
　　應(yīng)用miRBase、miRanda和TargetScan三個(gè)靶基因預(yù)測軟件對病例組和對照組表達(dá)差異的36個(gè)microRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測。合并三個(gè)預(yù)測數(shù)據(jù)庫的交集，

9、得到15個(gè)先心病差異表達(dá)microRNAs的447個(gè)預(yù)測靶基因，差異microRNAs的靶基因中含有與心臟發(fā)育密切相關(guān)的關(guān)鍵基因。
　　4.靶基因GO/Pathway分析及篩選microRNA靶序列SNPs
　　基因本體分析對靶基因進(jìn)行功能注釋，顯示先心病差異表達(dá)microRNA調(diào)控的靶基因涉及多方面的功能，其中富集度最高的生物學(xué)過程相關(guān)功能條目為心臟右心室形態(tài)發(fā)生，相關(guān)靶基因?yàn)镹OTCH1、HAND1、ZFPM2、GATA

10、3，調(diào)控這4個(gè)靶基因的microRNA為let-7e-5p、 miR-222-3p和miR-433，在先心病患者血漿中表達(dá)均下調(diào)。KEGG pathway分析獲得靶基因與差異microRNAs的顯著性調(diào)控通路，多數(shù)通路與心臟發(fā)育、腫瘤發(fā)生、出生缺陷、以及新生兒生長發(fā)育或心血管疾病有關(guān)，關(guān)注與MAPK通路有關(guān)的心臟發(fā)育重要的轉(zhuǎn)錄因子GATA4。對靶基因通過顯著性功能分析，構(gòu)建microRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。篩選出3個(gè)核心基因靶序列的1

11、1個(gè)功能性SNPs及23個(gè)可能參與調(diào)控的microRNA，作為研究先心病人群易感性關(guān)聯(lián)及其發(fā)生機(jī)制的參考。
　　5.GATA4基因3'UTR靶位點(diǎn)SNPs與CHDs易感性關(guān)聯(lián)
　　選擇GATA4基因microRNA靶序列中的8個(gè)位點(diǎn)SNPs進(jìn)行基因型檢測對比分析。有6個(gè)位點(diǎn)的等位基因或基因型分布頻率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與先心病易感性有關(guān)聯(lián)。rs867858A＞C位點(diǎn)中，C等位基因的OR為1.498和2.496倍; rs884

12、662T＞C位點(diǎn)中，C等位基因的OR為2.124和4.628倍; rs904018T＞C位點(diǎn)中，C等位基因的OR為0.481，T/C和C/C基因型者分別是T/T基因型患病風(fēng)險(xiǎn)的0.529倍和0.261倍; rs12825 C＞G位點(diǎn)中，G等位基因的OR為0.770，C/G和G/G基因型與CHDs的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可能無關(guān)、; rs12458A＞T位點(diǎn)中，T等位基因的OR為0.679，A/T和T/T基因型分別是AA基因型患病風(fēng)險(xiǎn)的0.612倍和0

13、.423倍; rs3203358C＞G位點(diǎn)中，G等位基因的OR為0.673，C/G和G/G基因型分別是C/C基因型患病風(fēng)險(xiǎn)的0.699倍和0.469倍。各標(biāo)簽SNPs與先心病不同臨床類型的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度有一些差異，總的關(guān)聯(lián)模式與總類結(jié)果比較一致。
　　6.連鎖不平衡分析以及單倍型分析
　　遺傳標(biāo)記位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析結(jié)果表明，rs12458-rs12825-rs867858之間存在緊密連鎖、rs904018-rs3203358之

14、間也存在緊密連鎖。Haploview軟件分析顯示，rs867858、rs904018和rs884662位點(diǎn)為標(biāo)簽SNPs。這3個(gè)標(biāo)簽SNPs的單倍型分析顯示，ATC單倍型和CCT單倍型在CHDs組與對照組間的頻率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，ATC單倍型為保護(hù)性單倍型，CCT單倍型是CHDs的風(fēng)險(xiǎn)性單倍型。
　　7.SNPs rs3203358影響miR-583對GATA4的表達(dá)調(diào)控
　　通過構(gòu)建SNPs rs3203358C/G不

15、同基因型GATA4-3' UTR表達(dá)載體，采用熒光素酶報(bào)告基因的方法研究發(fā)現(xiàn)，miR-583可以顯著降低野生型C等位基因的熒光素酶活性，而對突變型G等位基因的熒光素酶活性沒有影響。該多態(tài)由C＞G的變化，逃逸了miR-583對GATA4的負(fù)調(diào)控，使基因相對高表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　　1.通過microRNA表達(dá)譜芯片篩選及兩階段擴(kuò)大樣本的qRT-PCR驗(yàn)證，得到了5種血漿差異表達(dá)的microRNA可作為室間隔缺損診斷標(biāo)志物。

16、構(gòu)建microRNA多指標(biāo)Logisitic回歸分析模型，ROC曲線分析顯示，3種血漿microRNA聯(lián)合診斷模型的價(jià)值近似于5種microRNA的聯(lián)合，可顯著提高先心病的診斷效率，并具有臨床應(yīng)用的可行性。
　　2.生物信息學(xué)分析預(yù)測得出差異表達(dá)microRNAs與先心病發(fā)生相關(guān)的靶基因，以及靶基因中可能參與調(diào)控的多條信號(hào)通路。microRNAs可能通過與多個(gè)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來影響心臟發(fā)育和先心病的形成。篩選出的3個(gè)核心基因靶序列

17、的11個(gè)功能性SNPs可能會(huì)影響23種microRNA對靶基因的結(jié)合和表達(dá)調(diào)控，可作為深入研究的分子標(biāo)志物參考。
　　3.GATA4基因6個(gè)microRNA靶位點(diǎn)多態(tài)性與CHDs有關(guān)聯(lián)。rs867858位點(diǎn)A/C、C/C基因型、C等位基因以及rs884662位點(diǎn)T/C、C/C基因型、C等位基因可能會(huì)增加CHDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn);rs904018位點(diǎn)T/C、C/C基因型、C等位基因，rs12458位點(diǎn)A/T、T/T基因型、T等位基因，rs3

18、203358位點(diǎn)C/G、G/G基因型、G等位基因，rs12825 G等位基因可能會(huì)降低CHDs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。3個(gè)標(biāo)簽SNPs綜合分析表明，ATC單倍型為保護(hù)性單倍型，CCT單倍型為風(fēng)險(xiǎn)性單倍型。
　　4.成功構(gòu)建和鑒定攜帶目的基因片段的pMIR-GATA4的重組質(zhì)粒，并通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)初步驗(yàn)證了GATA4基因3'UTRrs3203358可能是miR-583的靶位點(diǎn)，miR-583可能通過該多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)合來調(diào)控GATA4基因的表