NKX2-5、TBX5和GATA4基因多態(tài)性與廣西壯、漢族人群先天性心臟病關(guān)系及其功能驗(yàn)證.pdf

1、目的：
　　NKX2-5、GATA4和TBX5是目前研究較多的與先天性心臟病(Congenital heart disease，CHD)相關(guān)的主要心臟轉(zhuǎn)錄因子，從胚胎發(fā)育開始，GATA4、NKX2-5和TBX5等多種轉(zhuǎn)錄因子通過單獨(dú)或者相互作用共同影響心臟的形成過程。有研究發(fā)現(xiàn)，NKX2-5、GATA4和TBX5等轉(zhuǎn)錄因子的缺失或者異常將影響相關(guān)通路的表達(dá)和心肌的發(fā)育，從而導(dǎo)致室間隔缺損(Ventricular septal de

2、fect，VSD)、房間隔缺損（Atrial septal defect，ASD)等先天性心臟病的發(fā)生。本課題將研究NKX2-5、GATA4和TBX5基因單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）與廣西壯族、漢族人群CHD遺傳易感性的關(guān)系，并對CHD的相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行功能驗(yàn)證。
　　方法：
　　采用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對照研究方法。納入廣西壯族、漢族ASD病例68例、VSD病例158例；

3、納入非心臟相關(guān)疾病患者234例做為對照組，以年齡、性別和民族對兩組進(jìn)行頻數(shù)匹配。運(yùn)用流行病學(xué)現(xiàn)場調(diào)查方法獲取研究對象的基本情況與病歷信息，采集其外周血并提取基因組DNA。通過美國國家環(huán)境健康科學(xué)研究所（National Institute of Environmental Health Sciences，NIEHS）數(shù)據(jù)庫對NKX2-5、GATA4和TBX5基因SNP進(jìn)行篩選，獲得符合要求的多態(tài)性位點(diǎn)分別為NKX2-5：rs688277

4、6，TBX5：rs11067101、rs883079、rs3782467，GATA4：rs867858、rs904018、rs804287、rs4841588。選用TaqMan-MGB實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）法對所有位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。使用SPSS18.0軟件分析相應(yīng)位點(diǎn)SNP與CHD遺傳易感性的關(guān)系

5、，所用統(tǒng)計(jì)方法包括t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)和多因素Logistic回歸模型。利用軟件Haploview4.2對每個(gè)位點(diǎn)的對照組樣本進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡（hardy-weinberg equilibrium，HWE）檢驗(yàn)。對實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的與CHD遺傳易感性有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，通過microRNA.org數(shù)據(jù)庫(http://www.microrna.org/)進(jìn)行功能預(yù)測，若是微小RNA（microRNA，miRNA）潛在靶位點(diǎn)，利用網(wǎng)站http:

6、//snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm及SNPInFO軟件對有潛在作用的miRNA進(jìn)行篩選。最后通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證該位點(diǎn)對篩選出的miRNA的靶向結(jié)合作用。
　　結(jié)果：
　?。?）納入對象情況：納入的病例和對照在年齡和民族的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），性別的分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007），但VSD組和對照組在年齡、性別和民族的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

7、均有P＞0.05）。（2）HWE檢驗(yàn)：經(jīng)HaploView4.2軟件檢驗(yàn)，位點(diǎn)rs904018對照組基因型頻率不符合HWE（χ2=126.39，P=0.000），其他位點(diǎn)的對照組基因型頻率均符合HWE（均有P＞0.05）。
　?。?）基因型頻率與CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系：經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，位點(diǎn)rs4841588基因型GT/TT能增加CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，rs867858位點(diǎn)基因型AC/CC能增加CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，也能單獨(dú)增加ASD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而r

8、s883079位點(diǎn)基因型CT/TT能降低CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，也能單獨(dú)降低ASD和VSD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。未發(fā)現(xiàn)其他多態(tài)性位點(diǎn)與CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。
　?。?）民族、性別分層分析：以民族和性別作為分層變量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs4841588、rs867858和rs883079的基因型頻率與CHD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（5）交互作用分析：經(jīng)統(tǒng)計(jì)，rs804287和rs11067101位點(diǎn)之間（OR=0.877，95％

9、CI：0.784~0.981,P=0.021）、rs4841588和rs867858位點(diǎn)之間（OR=1.082，95%CI：1.005~1.163,P=0.035）存在基因-基因交互作用。
　　（6）雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)：功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入miR375 mimic野生質(zhì)粒組的相對熒光素酶活性值為：21.35±1.47；未轉(zhuǎn)入mimic的野生質(zhì)粒組為：22.95±0.96；轉(zhuǎn)入miR375 mimic的突變型質(zhì)粒組為：24.1