基于iTRAQ技術(shù)IVF子代臍靜脈差異蛋白研究.pdf

1、1.研究目的:盡管已經(jīng)有研究結(jié)果顯示IVF子代會(huì)出現(xiàn)血管代謝紊亂、全身性和肺循環(huán)功能紊亂以及心血管結(jié)構(gòu)的重塑，但是這方面的機(jī)制尚且缺乏研究。我們的課題首先針對(duì)中國(guó)3-13歲的IVF子代及其條件吻合的對(duì)照組子代進(jìn)行了大樣本的血壓監(jiān)測(cè);然后借助臍靜脈來(lái)模擬子代血管，試圖從蛋白水平上發(fā)現(xiàn)差異功能蛋白;關(guān)于IVF子代后期生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)生紊亂的原因，目前說(shuō)法不一，有人認(rèn)為是IVF技術(shù)本身導(dǎo)致，有人認(rèn)為是不孕因素導(dǎo)致，而我們的研究最后試圖通過(guò)臨床和基

2、礎(chǔ)研究相結(jié)合的方式來(lái)發(fā)現(xiàn)這些蛋白差異表達(dá)的原因，從而挖掘出IVF子代血管功能紊亂的機(jī)制。
　　2.材料和方法:
　　(1)對(duì)在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院借助IVF技術(shù)和自然妊娠出生的3-13歲的子代進(jìn)行隨訪，以新鮮胚胎移植出生的單胎為實(shí)驗(yàn)組，以同期相應(yīng)的自然妊娠出生的單胎作為對(duì)照組，對(duì)其身高、體重、BMI、收縮壓、舒張壓和心率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所選的IVF均為管性不孕，另外兩組均排除子代出生時(shí)血管功能缺陷、家族型血管疾病、妊娠

3、高血壓和妊娠高血糖。
　　(2)從浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院分別收集IVF組和對(duì)照組臍血管14例以及45例IVF組和48例對(duì)照組臍血。入選標(biāo)準(zhǔn)為:產(chǎn)婦的年齡為25-35歲，孕周足月，單胎妊娠、出生體重為大于2500g小于4000g，剖腹產(chǎn)，并且排除各種妊娠并發(fā)癥和子代出生缺陷。其中3例IVF組和3例對(duì)照組的臍靜脈用來(lái)提取蛋白用于蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)。其余用于后面的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(熒光定量PCR和western blotting)和免疫組化實(shí)驗(yàn)。利用

4、碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒測(cè)量了臍血中的雌激素濃度。
　　(3)體外實(shí)驗(yàn)以人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為研究對(duì)象，通過(guò)不同濃度的雌激素處理，采用熒光定量PCR技術(shù)和western blotting技術(shù)檢測(cè)lumican和vimentin的表達(dá)水平。
　　(4)利用小RNA干擾技術(shù)將HUVECs的vimentin干擾后，利用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和transwell方法分別檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞周期和細(xì)胞的遷移能力

5、。
　　3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　(1)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示在3-6歲和6-13歲組中，IVF組的收縮壓和舒張壓均顯著性高于對(duì)照組。
　　(2)應(yīng)用iTRAQ檢測(cè)2組臍血管差異蛋白的表達(dá)，我們總共鑒定到723個(gè)蛋白，其中上調(diào)蛋白335個(gè)，下調(diào)蛋白388個(gè)。借助特征分析(Correlation-based FeatureSelection)技術(shù)，根據(jù)變化倍率至少為+/-1.2倍，最終篩選到了47個(gè)差異蛋白，其中20個(gè)上調(diào)

6、，27個(gè)下調(diào)。對(duì)這47個(gè)差異蛋白進(jìn)行IPA生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與血管系統(tǒng)發(fā)育和代謝功能相關(guān)。
　　(3)從蛋白組學(xué)結(jié)果中篩選了一個(gè)上調(diào)蛋白lumican和下調(diào)蛋白vimentin進(jìn)行驗(yàn)證。熒光定量PCR和western blotting結(jié)果與蛋白組學(xué)結(jié)果是一致的。
　　(4) IVF組的臍血雌激素濃度是顯著高于對(duì)照組的。說(shuō)明IVF子代在胚胎發(fā)育過(guò)程中受到了高雌激素的刺激，因此高雌激素有可能是引發(fā)這些蛋白差異表達(dá)的重

7、要原因。
　　(5)不同濃度的雌激素處理HUVECs后發(fā)現(xiàn)，高濃度的雌激素會(huì)上調(diào)lumican的表達(dá)，卻抑制vimentin的表達(dá)。這一結(jié)果和蛋白組學(xué)的結(jié)果是吻合的。說(shuō)明我們前面的假設(shè)“雌激素是引發(fā)IVF子代臍血管蛋白差異表達(dá)的重要因素”是正確的。
　　(6)把HUVECs中的vimentin干擾后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了皺縮，細(xì)胞周期最阻滯于S期，細(xì)胞的遷移能力也受到了抑制，說(shuō)明該蛋白的表達(dá)下調(diào)會(huì)影響到血管內(nèi)皮行使正常的生理功能