基于iTRAQ-MS技術(shù)HIV-AIDS肺脾氣虛證差異表達(dá)蛋白研究.pdf

1、目的：運(yùn)用蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)篩選 HIV/AIDS肺脾氣虛證差異表達(dá)蛋白，并對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，研究差異表達(dá)蛋白的功能，探討差異表達(dá)蛋白與 HIV/AIDS肺脾氣虛證臨床證候的聯(lián)系，探索 HIV/AIDS肺脾氣虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、按 HIV/AIDS肺脾氣虛證診斷量表，共納入 HIV/AIDS肺脾氣虛證患者25例，同地區(qū)健康人16例作為對(duì)照組，采集受試者血清樣本；
　　2、采用 Huma

2、n-14多重離心親和去除系統(tǒng)去除血清中高豐度蛋白，并采用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)高豐度蛋白去除效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià)；
　　3、運(yùn)用 iTRAQ-MS技術(shù)對(duì)血清中的蛋白進(jìn)行分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用 Mascot軟件對(duì) uniprot.human.fasta數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查庫(kù)鑒定分析，并采用 Proteome Discoverer軟件對(duì)肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析，篩選出 HIV/AIDS肺脾氣虛證差異表達(dá)蛋白；
　　4、生物信息學(xué)分析

3、利用本地化序列比對(duì)軟件 NCBI BLAST+將鑒定到的蛋白質(zhì)與 SwissProt human數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，利用 Blast2GO中的Mapping功能對(duì)目標(biāo)蛋白比對(duì)序列所關(guān)聯(lián)的基因本體（GO）功能條目進(jìn)行提取，分析目標(biāo)蛋白所參與的生物過(guò)程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）。利用KAAS(KEGG

4、 Automatic Annotation Server)將目標(biāo)蛋白序列與 KEGG GENES數(shù)據(jù)庫(kù)中的人類(lèi)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)同源/相似蛋白的KO（KEGG Orthology）號(hào)注釋到相關(guān)KEGG通路上，分析確定目標(biāo)蛋白參與的最主要的代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　結(jié)果：
　　1、 HIV/AIDS肺脾氣虛證組和健康對(duì)照組在年齡、性別組成、CD8水平上無(wú)顯著性差異（p＞0.05），HIV/AIDS肺脾氣虛證患者 CD4水平

5、、CD4/CD8水平較健康對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；
　　2、 SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果示去除高豐度蛋白后血清蛋白樣品電泳后條帶明顯增多，高豐度蛋白遮蔽作用明顯降低，不同分子量的蛋白分離清晰；
　　3、經(jīng)過(guò)去除高豐度蛋白、酶解消化、iTRAQ試劑標(biāo)記、LC-MS質(zhì)譜分析、Mascot查庫(kù)共鑒定出唯一肽段（Unique Peptide）2612個(gè)，蛋白質(zhì)組（ProteinGroup）279個(gè)，其中各

6、通道標(biāo)記標(biāo)簽皆有定量信息的蛋白質(zhì)組195個(gè)；
　　4、以質(zhì)譜結(jié)果中組間比值改變結(jié)合t-test分析P value值進(jìn)行差異表達(dá)蛋白篩選：1.以倍數(shù)改變＞1.2或＜0.83為標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定差異表達(dá)蛋白4個(gè)，其中Apolipoprotein A-II、cDNA FLJ93143 highly similar to Homo sapiens complement component7表達(dá)上調(diào)，Leucine-rich repeat pro

7、tein1、Urea transporter2表達(dá)下調(diào)；2.以倍數(shù)改變＞1.15或＜0.87為標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定差異表達(dá)蛋白8個(gè)，其中Serine/cysteine proteinase inhibitor clade G member1 splice variant2、Apolipoprotein A-II、cDNA FLJ93143 highly similar to Homo sapiens complement component7表

8、達(dá)上調(diào)，Zinc-alpha-2-glycoprotein、Urea transporter2、THAP domain-containing protein4、Apolipoprotein B、Leucine-rich repeat protein1表達(dá)下調(diào)；
　　5、僅以p value值＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選出24個(gè)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示，差異表達(dá)蛋白生物過(guò)程涉及細(xì)胞殺傷、生物粘附、多細(xì)胞組織過(guò)程、單一器官生物過(guò)程、細(xì)胞遷移、

9、復(fù)制等9個(gè)方面；分子功能涉及受體激活、轉(zhuǎn)運(yùn)活化、結(jié)合3個(gè)方面；細(xì)胞組分涉及細(xì)胞成分、膜成分、細(xì)胞外區(qū)域、膜內(nèi)腔、大分子混合物5個(gè)方面；
　　6、 KEGG通路分析顯示差異表達(dá)蛋白主要涉及代謝或信號(hào)通路包括：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Fc-γ-R介導(dǎo)的吞噬作用、金黃色釀膿葡萄球菌感染、脂肪消化吸收、維生素消化吸收、受體激活、病毒引起的致癌作用、朊病毒疾病、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)聚沉、阿米巴病10個(gè)。
　　結(jié)論：
　　1、多重親和離心去除系統(tǒng) H

10、uman-14能有效去除血清中14種高豐度蛋白，有效降低血清中高豐度蛋白對(duì)低豐度蛋白檢測(cè)的遮蔽作用，有利于對(duì)疾病相關(guān)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，有利于中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)的研究。
　　2、運(yùn)用iTRAQ-MS技術(shù)篩選出了HIV/AIDS肺脾氣虛證一系列差異表達(dá)蛋白，提示iTRAQ技術(shù)用于HIV/AIDS相關(guān)中醫(yī)證候生物標(biāo)志物的研究有良好的前景。差異表達(dá)蛋白在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚未完全清楚，還需進(jìn)一步評(píng)價(jià)其可靠性。
　　3、中醫(yī)證候作為

11、疾病發(fā)生演變過(guò)程中特定階段癥狀和體征的概括是有生物學(xué)基礎(chǔ)的。對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示，差異表達(dá)蛋白分子功能及信號(hào)、代謝通路多與免疫和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收相關(guān)。尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、載脂蛋白A-II、鋅-α-2-糖蛋白異常表達(dá)與HIV/AIDS肺脾氣虛證臨床癥狀：咳痰清稀、乏力氣喘、胸悶、心慌心悸、泄瀉等密切相關(guān)，可能是 HIV/AIDS肺脾氣虛證潛在的生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　4、鋅-α-2-糖蛋白在蛋白和基因表達(dá)水平的下調(diào)涉及多