基于iTRAQ技術對肝癌轉移相關蛋白的初探.pdf

1、肝癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其中70％-90%為肝細胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）。全世界范圍內年肝癌死亡人數約為74.5萬，占癌癥致死率的第三位。其中我國的新增病例和死亡病例均占全球的一半。肝癌臨床治療失敗及死亡率高的主要原因是大部分病例初次診斷即有轉移，據統(tǒng)計80%以上的患者最終死于肝癌侵襲和轉移。但對肝癌轉移的生物學機制未完全闡明，仍未有轉移及預后相關的臨床檢測生物標志物，所以發(fā)掘肝

2、癌轉移相關蛋白具有重要意義。
　　腫瘤的侵襲和轉移是一項動態(tài)復雜的過程，受環(huán)境影響及多種信號分子的調控。惡性腫瘤是一種多基因病同時也是一種蛋白質組疾病，因為基因功能的實現(xiàn)要靠生物學功能的執(zhí)行者蛋白分子。所以本研究通過以同位素標記相對和絕對定量（ isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）技術結合二維液相色譜-串聯(lián)質譜（2D-LC-MS/MS）的高通量的蛋

3、白組學對不同轉移潛能細胞株的蛋白組學研究，篩選并鑒定出與轉移相關的蛋白，為后續(xù)肝癌轉移的預警和干預研究提供新的靶標。
　　我們研究選擇三株具有相同遺傳背景不同轉移潛能的肝癌細胞MHCC97-L、MHCC97-H及HCCLM3作為分析研究材料，源于同一名肝癌病人的新鮮瘤組織分離，并進一步通過裸鼠體內肝臟原位移植和體外分篩的方法建立。經過收集胞質蛋白，脫鹽、濃縮、酶解并用iTRAQ技術對其進行標記，應用質譜技術對肽段進行檢測分析，以實

4、現(xiàn)對差異蛋白的分離和鑒定。得到的結果與數據庫進行比對，對蛋白進行注釋。應用生物信息學軟件對差異表達的蛋白進行GO（Gene ontology）功能分析和通路分析以篩選轉移相關的目標蛋白。并用RT-PCR和Western blot對其中部分差異蛋白進行驗證。免疫組化分析檢測從差異表達蛋白中優(yōu)先選出的目標蛋白 PLEC并對其表達與肝癌臨床病理特征及預后關系進行統(tǒng)計學分析。
　　經過 iTRAQ標記并質譜檢測分析，共發(fā)現(xiàn)鑒定到1170個

5、蛋白，其中在L/H（MHCC97-L/MHCC9-H）組鑒定發(fā)現(xiàn)47個差異表達蛋白，在M/H（HCCLM3/MHCC97-H）組鑒定發(fā)現(xiàn)65個差異表達蛋白。生物信息學分析提示L/H和M/H組差異表達的蛋白主要參與酶的催化和細胞間的粘附，并且參與細胞代謝的過程。應用RT-PCR對差異較大的蛋白進行了轉錄水平的驗證，符合質譜結果。應用Western blot在蛋白水平上的驗證，PLEC在高轉移細胞株MHCC97-H和HCCLM3中表達上調，

6、 SHMT2在HCCLM3中的表達上調，LDHA在HCCLM97-H中表達上調。在免疫組化染色進一步證實：PLEC在胞膜中的表達在癌組織中較癌旁組織高，PLEC在胞膜中的表達量與TNM分期及腫瘤大小呈正相關相關（P=0.019，P=0.044）；且Kaplan-Meier生存曲線分析顯示PLEC胞膜中高表達的患者的生存率低（P=0.016）；Cox回歸分析證明 PLEC在胞膜中的表達升高是肝癌預后的獨立危險因素，提示PLEC在細胞膜中高