基于iTRAQ技術(shù)的結(jié)直腸癌蛋白標志物鑒定.pdf

1、背景與目的:
　　 結(jié)直腸癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)資料顯示，結(jié)直腸癌居男性常見惡性腫瘤發(fā)病率第三位，居女性常見惡性腫瘤發(fā)病率第二位，2008年度全世界估計總新增病例超過120萬例，居第2位，死亡病例超過608，700人，居第4位。結(jié)直腸癌發(fā)病率具有明顯地域差異。其中高發(fā)地區(qū)為澳大利亞、新西蘭、歐洲和北美，非洲和中南亞為低發(fā)地區(qū)。世界范圍內(nèi)發(fā)病率男女之比約為1.16∶1。
　　

2、 隨著我國人民生活水平的不斷提高和改善，以及飲食習(xí)慣的變化，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率亦逐年升高，大中城市尤其明顯，資料表明，中國大陸13.4億人口，結(jié)直腸癌在全國腫瘤登記地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病率居第三位，發(fā)病39.7萬例，發(fā)病率29.62/10萬，居男性發(fā)病率第四位，女性發(fā)病率第三位;結(jié)直腸癌死亡率居第五位，死亡19.0萬例，死亡率14.15/10萬，居男性死亡率第五位，女性死亡率第四位。
　　 多項研究顯示，與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的危

3、險因素包括吸煙、缺乏體育鍛煉、超重及肥胖、紅色及加工處理的肉類消費和過度飲酒。結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個歷時數(shù)十年，多階段進展，多因素參與，伴隨一系列的分子事件的復(fù)雜進程。多年的研究揭示了大量的發(fā)生于DNA和RNA水平的分子特征性改變，形成了人們現(xiàn)在對結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機制的認識，包括了基因組DNA序列的突變，DNA拷貝數(shù)的改變，啟動子超甲基化，miRNA表達水平改變等，最終這些變化影響了結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)表達譜的改變。
　　 影響

4、結(jié)直腸癌預(yù)后的最重要因素就是早期診斷與早期治療，研究顯示TNMⅠ期患者的五年生存率可達90％以上，而有遠處器官轉(zhuǎn)移的Ⅳ期患者5年生存率只有大約10％。雖然經(jīng)過多年的基礎(chǔ)和臨床共同努力，結(jié)直腸癌死亡率和生存周期并未獲得明顯改善和延長，究其原因，在于相當一部分患者在就診時就已經(jīng)處于腫瘤進展期。有報道表明，30-40％的就診患者已經(jīng)存在區(qū)域侵潤和轉(zhuǎn)移性疾病，并無法通過單純的手術(shù)治療獲得治愈，并且超過一半的患者術(shù)后復(fù)發(fā)并且罹難于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

5、研究表明，通過對廣泛人群進行篩查的結(jié)直腸癌早期檢測和診斷，以及對早期結(jié)直腸癌進行干預(yù)，可以有效的延長生存期，而這一切依賴于高效而準確的結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后生物標記物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用。
　　 蛋白質(zhì)參與了人類生理、病理過程的絕大部分活動，在疾病發(fā)生、機體反應(yīng)和康復(fù)的各個進程都發(fā)揮著重要的作用，因此，作為生命活動的重要作用分子形式，蛋白質(zhì)標志物自然是生物標志物篩選與鑒定的焦點。
　　 iTRAQ技術(shù)是由美國ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(

6、Applied BiosystemsIncorporation, ABI)開發(fā)的同位素標記相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tags forrelative and absolute quantitation，iTRAQ)的簡稱，相對于傳統(tǒng)的定量鑒定，具有無可比擬的優(yōu)點:在同一實驗中，最多可以對多達4到8種不同樣本進行蛋白定量比較，可以對樣本中的絕大部分蛋白質(zhì)進行標記，比如可以對磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻譯后修飾蛋白進行定量、定性研

7、究，從中獲得更為詳盡的樣品信息，標記過程更簡便，在室溫條件下1小時即可完成，質(zhì)譜檢測更為靈敏。
　　 本課題研究采用的蛋白組學(xué)研究策略是以同位素相對絕對定量技術(shù)(iTRAQ)為基礎(chǔ)，通過聯(lián)合多維固/液相色譜技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分離和鑒定蛋白質(zhì)，對比結(jié)直腸癌與配對的正常對照粘膜組織蛋白質(zhì)組定量結(jié)果和同一患者術(shù)前與術(shù)后血清蛋白質(zhì)組定量結(jié)果，分別描繪結(jié)直腸癌患者組織對比和血清對比差異蛋白質(zhì)譜，通過比對組織和血清的差異蛋白質(zhì)譜，挑選一組在

8、組織和血清中均有一致性差異表達的差異蛋白，經(jīng)生物信息學(xué)分析后行Wester blot、免疫組化驗證，篩選出一組具有理想診斷和/或預(yù)后價值或可作為治療靶點的免疫組織化學(xué)標志物，以期提高結(jié)直腸癌疾病的早期診斷水平、改善患者預(yù)后和/或為治療提供可能的靶點。相比于以往的研究，本課題的創(chuàng)新性體現(xiàn)在在一次iTRAQ標記實驗中同時比對同一患者的組織與血清差異表達蛋白譜，篩選在組織學(xué)和血清學(xué)水平具有一致性差異的蛋白標志物，增強了后期驗證結(jié)果的可靠性。<

9、br>　　 方法:
　　 本研究收集1例結(jié)直腸癌患者癌組織和配對正常粘膜組織，以及同一患者的術(shù)前和術(shù)后血清，經(jīng)蛋白提取和經(jīng)胰酶消化為多肽后，分別以同位素相對與絕對定量試劑盒(iTRAQ)標記組織與血清蛋白肽段，將二者混合后經(jīng)過強陽離子交換柱(SCX)和反相色譜柱(RPLC)的二維分離，之后聯(lián)用MALDI質(zhì)譜技術(shù)對分離后的樣品蛋白質(zhì)多肽質(zhì)譜圖進行定量鑒定，經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫檢索，描繪結(jié)直腸癌患者組織與血清差異蛋白質(zhì)譜。挑選出感

10、興趣的目的蛋白后，登錄GeneOntcology與Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫進行差異蛋白質(zhì)的亞細胞結(jié)構(gòu)定位和功能分析。
　　 經(jīng)生物信息學(xué)分析，挑選出差異表達蛋白標志物，經(jīng)Western blot和免疫組織化學(xué)法驗證其表達水平。收集除用于iTRAQ定量的結(jié)直腸癌病例以外的3例與之臨床病理特征匹配的結(jié)直腸癌病例，共4例的結(jié)直腸癌腫瘤組織及配對正常組織，經(jīng)前述冰凍組織保存及蛋白提取方法，進行蛋白提取、定量后，分別取總蛋白各20μg進

11、行Western blot驗證，以PD QUEST軟件半定量分析。收集80例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和匹配的正常對照粘膜組織，經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋處理后切片，經(jīng)逐步脫蠟至水、雙氧水(H2O2)封閉內(nèi)源酶活性、高溫高壓抗原修復(fù)、10％牛血清封閉、抗原特異性一抗過夜孵育、漂洗后種屬特異二抗常溫孵育、DAB顯色及蘇木素復(fù)染后，由兩位病理醫(yī)師分別對免疫組化(IHC)結(jié)果進行雙盲評分。IHC評分標準:在5-10個隨機視野觀察200個上皮細胞，從免疫

12、陽性染色細胞比例和免疫染色強度兩個方面進行綜合評分，兩位醫(yī)師的評分平均后作為最終結(jié)果。根據(jù)免疫陽性細胞比例不同，分為:0分，陰性;1分，＜10％陽性;2分，11％-50％陽性;3分，≥51％陽性。根據(jù)免疫染色強度不同，分為:0分，陰性;1分，弱陽性;2分，陽性;3分，強陽性。為系統(tǒng)評價蛋白標志物Prenylcysteine oxidase1和Peroxiredoxin-4的診斷和/或預(yù)后價值。為評價篩選的蛋白標志物的診斷可靠性，以免疫組

13、化評分為依據(jù)，從低到高設(shè)立7個診斷閾值，分別是評分≥0、1、2、3、4、5和6。統(tǒng)計分析在不同的診斷閾值下，蛋白標志物用于結(jié)直腸癌(CRC)診斷的特異度、靈敏度、陰性預(yù)測值與陽性預(yù)測值、約登指數(shù)(Youden Index)和一致性檢驗Kappa值，繪制受試者工作特征曲線(ROC)，確定界值點，計算ROC曲線下面積AUC。
　　 結(jié)果:
　　 以同位素相對與絕對定量(iTRAQ)為基礎(chǔ)、固/液相二維分離及MALDI質(zhì)譜技術(shù)

14、描繪結(jié)直腸癌組織與血清差異蛋白譜，經(jīng)Scaffold篩選，NCBI human庫檢索，共鑒定到血清蛋白198個，其中差異蛋白102個;腫瘤組織鑒定到蛋白568個，其中差異蛋白391個。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，共有13個蛋白在血清和組織中都鑒定為差異表達蛋白，其中5個蛋白在腫瘤組織中表達水平上調(diào)，8個在腫瘤組織中表達水平下調(diào)，10個蛋白在術(shù)前血清中表達水平上調(diào)，3個蛋白在術(shù)后2周血清表達水平上調(diào)，4個蛋白表達差異具有一致性（我們規(guī)定，在腫瘤組織表達

15、升高/降低和在術(shù)前血清表達升高/降低，稱為表達差異具有一致性）。通過檢索UniProt knowledgebase數(shù)據(jù)庫(Swiss-Prot/TrEMBL，www.expasy.org)和GeneOntology(GO) Database數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)，我們對篩選出的13個差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能進行了GO分析。GO分析結(jié)果顯示此13個差異蛋白質(zhì)，大部分(84.6％)具有兩個或兩個以上

16、的分子功能或參與的生物學(xué)進程，其中與結(jié)合(Binding)功能有關(guān)的占84.6％，此外，還與生物功能調(diào)節(jié)(76.9％)，細胞進程(69.2％)，代謝進程(69.2％)和應(yīng)激(84.6％)功能相關(guān)。我們選擇了Prenylcysteine oxidase1, Peroxiredoxin-4, Lumican和Complement factor B這四個具有一致性差異表達的蛋白標志物進行Western-Blot實驗，結(jié)果證實Prenylcys

17、teine oxidase1， Peroxiredoxin-4這2個蛋白的表達量在腫瘤組織中高于正常組織。隨后對這2個蛋白進行免疫組化驗證，利用SPSS18.0軟（卡方檢驗與Wilcoxon signed ranks檢驗）對免疫組化評分進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明:與配對的正常對照組織相比，Prenylcysteine oxidase1和Peroxiredoxin-4在腫瘤組織的上調(diào)表達具有統(tǒng)計學(xué)意義（二者均P＜0.01），二者分別在85％

18、和71.25％的結(jié)直腸癌組織上調(diào)表達，卡方檢驗提示Peroxiredoxin-4的上調(diào)表達與淋巴結(jié)侵襲和TNM分期相關(guān)(P＜0.05)，Prenylcysteine oxidase1的上調(diào)表達與病例臨床特征如年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)侵襲之間并無顯著相關(guān)性。經(jīng)Logistic回歸分析病例臨床病理特征和蛋白標志物在腫瘤組織和正常組織的差異表達程度相關(guān)性，提示Prenylcysteine oxidase1和Per

19、oxiredoxin-4在腫瘤組織和正常組織的差異表達程度均與淋巴結(jié)侵襲相關(guān)，OR值分別為3.386(95％可信區(qū)間，1.474-8.243)和2.858(95％可信區(qū)間，1.219-6.701)。Prenylcysteine oxidase1主要表達在胞漿，其陽性表達在95％的結(jié)直腸癌組織和60％的正常對照組織中被檢測到。Peroxiredoxin-4的表達分布于胞漿和部分細胞外間質(zhì)區(qū)域，其陽性表達可以在96.25％的結(jié)直腸癌組織和8

20、0％的對照正常組織樣本中檢測到。
　　 Prenylcysteine oxidase1診斷結(jié)直腸癌(CRC)的診斷閡值是免疫組化評分≥3，經(jīng)統(tǒng)計分析其CRC診斷特異度為93.75％，敏感度為76.25％，陽性預(yù)測值為92.4％，陰性預(yù)測值為79.8％，在該診斷閾值下，計算約登指數(shù)(YI)為70，收受者特征曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)為89.4％。Peroxiredoxin-4診斷結(jié)直腸癌(CRC)的診斷閾值是免疫組化評分

21、≥4，經(jīng)統(tǒng)計分析其CRC診斷特異度為96.3％，敏感度為63.8％，陽性預(yù)測值為94.4％，陰性預(yù)測值為72.6％，在該診斷閾值下，約登指數(shù)為60.1，收受者特征曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)為84.2％。
　　 結(jié)論:
　　 我們初步描繪了結(jié)直腸癌組織與血清差異表達蛋白質(zhì)譜，篩選出了一組具有較好診斷價值的蛋白標志物，驗證了Prenylcysteine oxidase1和Peroxiredoxin-4在癌組織中的上