結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移血清蛋白診斷模型的優(yōu)化和相關(guān)標志物的鑒定.pdf

1、第一部分應(yīng)用磁珠提取血清多肽結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)建立早期診斷結(jié)直腸癌的模型
　　目的:
　　應(yīng)用磁珠提取血清多肽結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)建立和驗證結(jié)直腸癌早期診斷模型并篩選出可早期診斷的蛋白標志物。
　　方法:
　　隨機選取46例結(jié)直腸癌患者和35例健康人的血清，用銅離子螯合磁珠提取血清多肽后用MALDI-TOF MS檢測肽質(zhì)量指紋圖譜，并應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件根

2、據(jù)不同的運算法則建立不同模型，并用另外45個腸癌血清標本和42個健康對照人群血清標本進行檢測，從中選出有最佳診斷性能的模型。同時，另選取46個其他腫瘤患者的血清標本中進行驗證。為進一步驗證該模型的性能，另選取其他269位腸癌患者的血清和110位健康對照人群的血清對所建立的模型進行驗證。對模型中的蛋白峰進一步通過串聯(lián)質(zhì)譜進行鑒定。
　　結(jié)果:
　　基于建模組和測試組的血清質(zhì)譜分析，我們發(fā)現(xiàn)基于Fisher算法的擁有5個差異蛋白

3、峰（m/z1778.97、1866.16、1934.65、2022.46和4588.53）的診斷模型具有最佳的判別性能。訓(xùn)練集的敏感度和特異度均為100％，測試集的敏感度和特異度分別為95.6％和83.3％。且該模型在診斷其他非腸癌腫瘤時，僅有54.3％(25/46)的準確性。進一步進行外源性驗證時，該模型可獲得94.4％(254/269)的敏感度，75.5％(83/110)的特異度和88.9％(337/379)的準確性。隨后，我們進一

4、步用串聯(lián)質(zhì)譜對上述蛋白峰進行鑒定，結(jié)果判定前面4個都是補體C3f的片段。
　　結(jié)論:
　　基于Fisher算法的擁有上述5個蛋白峰的診斷模型，能有效區(qū)分腸癌患者與健康對照組和其他腫瘤，而且該模型可能具有腸癌特異性。在該模型中，在腸癌患者中濃度明顯下降的血清補體C3f，可能與腸癌的發(fā)生相關(guān)。
　　第二部分應(yīng)用磁珠提取血清多肽結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)建立預(yù)測結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的模型
　　目的:
　　本研究擬

5、應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)從結(jié)直腸癌伴或不伴肝轉(zhuǎn)移患者血清中篩選蛋白標志物，建立相應(yīng)的模型，從而有助于預(yù)測肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　方法:
　　選取在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院結(jié)直腸癌專業(yè)組的手術(shù)病例，根據(jù)隨訪的結(jié)果將結(jié)直腸癌患者分為3類:無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者（根治術(shù)后至少3年以上無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移）、同時性肝轉(zhuǎn)移患者（診斷腸癌時或根治術(shù)后6個月內(nèi)發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移）和異時性肝轉(zhuǎn)移患者（根治術(shù)后6個月后發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移）。本研究選取其中兩類:64例異時性肝轉(zhuǎn)移患者和64例無復(fù)發(fā)

6、轉(zhuǎn)移患者，隨機抽取兩組各40個血清樣品，建立決策樹模型，并用剩余的血清樣品用來測試該模型的性能。并進一步將此模型中的蛋白峰通過串聯(lián)質(zhì)譜進行鑒定。
　　結(jié)果:
　　異時性肝轉(zhuǎn)移和無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移兩組患者在性別、年齡、腫瘤分布、TNM分期和組織分化程度上無顯著差別。術(shù)前血清癌胚抗原(CEA)水平不能用于預(yù)測根治術(shù)后肝轉(zhuǎn)移。本研究獲得8個蛋白峰(m/z3315、6637、1207、1466、4167、4210、2660和4186)所建立

7、的決策樹模型能夠準確區(qū)分訓(xùn)練集中82.5％(33/40)的無轉(zhuǎn)移和80％(32/40)的異時性轉(zhuǎn)移，測試集中79.2％(19/24)的無轉(zhuǎn)移和70.8％(17/24)的異時性轉(zhuǎn)移。決策樹模型中使用的蛋白峰通過串聯(lián)質(zhì)譜被鑒定為甲胎蛋白的片段、補體C4A的片段、纖維蛋白原α的片段、真核肽鏈釋放因子GTP結(jié)合亞基ERF3B的片段和血管緊張素原的片段等。
　　結(jié)論:
　　在本研究內(nèi)性別、年齡、腫瘤分布、TNM分期和組織分化程度相匹配

8、的患者中，包括8個蛋白峰所建立的決策樹模型則可以很好地預(yù)測根治術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　第三部分結(jié)直腸癌組織差異表達蛋白的鑒定和分析
　　目的:
　　腸癌是常見的惡性腫瘤，如果在早期發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)患者可通過手術(shù)治療治愈，但實際上大多患者在發(fā)現(xiàn)時已處于進展期，預(yù)后較差。因此，早期診斷腸癌是很迫切的需要。本研究通過組織蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定用于早期診斷腸癌的生物標志物。
　　方法:
　　收集5位病理證實為結(jié)直腸癌患者

9、的腸癌、癌旁和正常粘膜組織，應(yīng)用雙向電泳技術(shù)得到雙向電泳凝膠圖譜，經(jīng)圖像分析尋找差異表達的蛋白質(zhì)斑點。后將蛋白點切下經(jīng)酶切，進行質(zhì)譜分析，再查庫進行蛋白質(zhì)鑒定。然后，進一步用差異蛋白進行GO分析和pathway分析等生物信息學(xué)分析。此外，還應(yīng)用Western Blot方法從蛋白水平驗證候選的蛋白標志物。
　　結(jié)果:
　　總計有50個蛋白質(zhì)斑點在正常組與癌旁/癌組表達差異，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，得到31個可能與腸癌發(fā)生相關(guān)的差異蛋白。

10、Gene Ontology(GO)分析顯示，按細胞組分分類，細胞質(zhì)和線粒體的差異蛋白所占比例較大;按分子功能分類，涉及細胞結(jié)合、氧化還原酶活性、硫氧還蛋白過氧化物酶活性的比例較大;按生物學(xué)過程分類，氧化還原、抗凋亡、糖皮質(zhì)激素刺激反應(yīng)、脂肪代謝等所占比例較大。Western Blot檢測顯示I-FABP在結(jié)直腸癌組織中表達顯著下調(diào)，HSP27在結(jié)直腸癌組織中表達顯著上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.運用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析和生物信