人類γδT細(xì)胞抗原表位肽的鑒定和健康人γδT細(xì)胞克隆的建立及鑒定.pdf

1、盡管γδT細(xì)胞在機(jī)體抗感染、抗腫瘤的固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，但是目前所發(fā)現(xiàn)的配體抗原僅限于十余種，根本無法與承擔(dān)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的()cpT細(xì)胞可識(shí)別數(shù)以億萬(wàn)計(jì)的抗原表位肽相比。此外，有關(guān)γδT細(xì)胞的表位蛋白多肽則尚無報(bào)道。因此，有必要進(jìn)行γδT細(xì)胞蛋白抗原表位肽的研究，以澄清活化γδT細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另一方面，活化的γδT細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞的重要效應(yīng)細(xì)胞，一旦獲得具有活化γδT細(xì)胞的抗原表位多肽，可為體內(nèi)外激活γ

2、δT細(xì)胞提供一個(gè)有效的活化手段。為此，我們所關(guān)注的第一個(gè)科學(xué)問題是是否存在人類γδT細(xì)胞的抗原表位?如果存在，多個(gè)串聯(lián)抗原表位多肽是否比單個(gè)抗原表位肽更具刺激γδT細(xì)胞的能力?圍繞上述兩個(gè)科學(xué)問題我們開展了人類γδT細(xì)胞的抗原表位肽的鑒定研究。 我們實(shí)驗(yàn)室先前根據(jù)三個(gè)來源于卵巢癌組織浸潤(rùn)的γδT細(xì)胞的TCRδ鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)3的(CDR3δ)基因序列，合成了三條CDR3δ多肽OT1、OT2、OT3，并且以這三條多肽為探針，

3、在噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)中篩選與CDR35多肽結(jié)合的十二肽，作為γδT細(xì)胞的候選抗原表位肽。我們獲得了7個(gè)能與探針特異性結(jié)合的候選抗原表位肽。體外實(shí)驗(yàn)表明，這些多肽能在一定程度上增強(qiáng)γδT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，提示這些多肽具有抗原表位活性。但是，可能由于這些多肽分子量小，因此，它們對(duì)δT細(xì)胞的活化能力較弱。為了增強(qiáng)這些潛在抗原表位肽激活γδT細(xì)胞的能力，我們?cè)噲D通過制備串聯(lián)抗原多肽的方式來提高其刺激活性。具體的實(shí)驗(yàn)思路為：通過分子克隆技術(shù)

4、，將表位肽串聯(lián)，并與無關(guān)載體蛋白GST連接構(gòu)建GST-表位融合蛋白表達(dá)載體，表達(dá)并鑒定了這些GST-表位融合蛋白的功能，以進(jìn)一步闡明該項(xiàng)策略的可行性。 這一研究的主要工作及其結(jié)果如下： 首先，我們通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)、3H摻入法、MTT摻入法證實(shí)篩選到的十二肽能在一定程度上刺激γδT細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其殺傷腫瘤的作用，提示這些十二肽可能是γδTCR特異性識(shí)別的抗原表位肽。這為進(jìn)一步澄清活化γδT細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。

5、 其次，采用同尾酶技術(shù)構(gòu)建了含不同表位組合方式的GST-表位融合蛋白的表達(dá)載體，通過ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，從分子水平和細(xì)胞水平證實(shí)這些原核表達(dá)的重組GST-表位融合蛋白能與探針OT3、OT3(V)-Fc分子及γδT細(xì)胞的TCR特異性結(jié)合。并且，利用CFSE染色和MTT摻入的方法，驗(yàn)證GST-表位融合蛋白可刺激γδT細(xì)胞群體的增殖作用。此外，GST-表位融合蛋白與γδT細(xì)胞孵育后，發(fā)現(xiàn)它們可以促進(jìn)γδT細(xì)胞的殺傷作用，且GST-串

6、聯(lián)表位融合蛋白的作用要強(qiáng)于GST-單表位融合蛋白。通過半定量RT-PCR和進(jìn)一步的ELISA定量分析，發(fā)現(xiàn)GST-表位融合蛋白能夠促進(jìn)γδT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α；此外，F(xiàn)as配體和顆粒酶B的表達(dá)也有所增加。 最后，我們觀察了GST-串聯(lián)表位融合蛋白刺激的人γδT細(xì)胞對(duì)荷瘤裸鼠的抑瘤作用。結(jié)果顯示，GST-串聯(lián)表位融合蛋白刺激的人γδT細(xì)胞治療組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)較未刺激γδT細(xì)胞治療組相比明顯受到抑制，小

7、鼠的生存期也有所延長(zhǎng)。 綜上，我們首次系統(tǒng)地驗(yàn)證了γδT細(xì)胞表位肽的存在。這些表位肽能在一定程度上刺激γδT細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)其殺傷腫瘤的作用。其次，通過構(gòu)建GST-表位融合蛋白并進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，串聯(lián)表位肽的γδT細(xì)胞活化效果要優(yōu)于單表位肽。這說明將表位串聯(lián)起來提高表位的γδT細(xì)胞活化能力的新策略是完全可行的。這將為基于γδT細(xì)胞的過繼免疫細(xì)胞治療腫瘤提供新型活化手段。 γδT細(xì)胞是一群特殊的T細(xì)胞，是連接固有免疫和特異

8、性免疫之間不可或缺的橋梁。由于γδT細(xì)胞在外周血中只占很少的比例，分離純化相對(duì)較繁瑣，這為深入研究γδT細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能帶來了一定的困難。因此，若能建立在體外可長(zhǎng)期培養(yǎng)的γδT細(xì)胞克隆，尤其是建立單個(gè)的γδT細(xì)胞克隆，將極大地促進(jìn)其抗原識(shí)別、細(xì)胞活化及功能等研究。為此，本文的第二方面工作為健康人γδT細(xì)胞克隆的建立及鑒定。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先探索了固相法擴(kuò)增的γδT細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇條件。其次，以60Co照射的同種異體PBMC作

9、為飼養(yǎng)細(xì)胞，以有限稀釋法對(duì)經(jīng)過陽(yáng)性分選的γδT細(xì)胞進(jìn)行克隆化。用流式細(xì)胞術(shù)及分子生物學(xué)檢測(cè)鑒定所獲克隆，以MTT摻入法對(duì)所獲克隆進(jìn)行細(xì)胞毒檢測(cè)。結(jié)果共獲得五株γδT細(xì)胞克隆，這五株克隆均為Vγ9Vδ2亞型，CD4分子和CD8分子表達(dá)均為陰性，對(duì)腫瘤細(xì)胞SKOV3均具有一定的殺傷作用。在這5株γδT細(xì)胞克隆中，有兩株為單克隆，且這兩株單克隆經(jīng)證實(shí)為相同克隆，其VδCDR3區(qū)序列為ACDTIPGDLVRADKLIFGKG，VγCDR3區(qū)序列