霍亂毒素B亞單位與糖尿病自身抗原表位肽融合基因的克隆、表達(dá)及鑒定.pdf

1、通過口服自身抗原誘導(dǎo)免疫耐受能夠延遲和抑止自身免疫型疾病和過敏反應(yīng)，但是口服誘導(dǎo)免疫耐受需要大劑量的抗原或者長期給予小劑量的抗原，而且只有在一個相當(dāng)窄的范圍內(nèi)有效，免疫致敏個體中免疫耐受難于誘導(dǎo)?；魜y毒素B亞單位分子(choleratoxinB,CTB)能夠克服上述缺點(diǎn)。CTB作為一種載體蛋白分子與糖尿病自身抗原胰島素B(InsulinB，InsB)鏈分子交聯(lián)后口服NOD(non-obesediabetic)小鼠，能夠顯著減輕胰島炎癥程

2、度和Ⅰ型糖尿病的發(fā)生率，而且所需的胰島素劑量只有單純使用胰島素的1/500-1/5000，但是化學(xué)交聯(lián)蛋白成份復(fù)雜，難于純化，而基因工程融合蛋白分子較化學(xué)交聯(lián)蛋白分子有明顯的優(yōu)越性，融合蛋白分子具有操作簡便，組分單一等特點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)通過重疊PCR技術(shù)分別將胰島素B鏈基因和谷氨酸脫羧酶(Glutamateaciddecarboxylase，GAD)(531-545)肽段基因分別融合到CTB基因的3'端，獲得融合基因CTB-InsB

3、(CI)，CTB-GAD(CG)。將CI、CG基因酶切后克隆到pET22b載體上，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)FML培養(yǎng)基中的乳糖誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后表明該菌株可以表達(dá)目的蛋白，CG的分子量為14KD，CI的分子量為17KD，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式表達(dá)。CG的表達(dá)量占全菌蛋白的30﹪左右，CI的表達(dá)量占全菌蛋白的35﹪左右。超聲破菌后獲得包涵體，經(jīng)2M尿素溶液洗滌后，溶于8M的尿素溶液中，