HER2-neu聯(lián)合細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)篩選、基因克隆、表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的:
　　 1.預(yù)測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2/neu)的CTL和B細(xì)胞聯(lián)合表位,為其單克隆抗體的制備,表位疫苗設(shè)計(jì)和相關(guān)免疫效應(yīng)等研究提供理論依據(jù)。
　　 2.綜和多參數(shù)表位預(yù)測(cè)分析,篩選出3個(gè)CTL和B細(xì)胞聯(lián)合表位多肽,分別構(gòu)建含預(yù)測(cè)CTL和B細(xì)胞聯(lián)合表位多肽的原核重組質(zhì)粒,采用6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(His.tag)表達(dá)聯(lián)合表位蛋白,并用SDS-PAGE、Western Blot進(jìn)行分析鑒定。
　　 方法:

2、r>　　 1.以HER2/neu的完整氨基酸序列為研究基礎(chǔ),用SOPMA、HNN、GOR三種方案分析比較HER2/neu二級(jí)結(jié)構(gòu),并用親水性、極性、柔韌性、表面可及性和抗原性等多參數(shù)分析其B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位,采用吳氏平均抗原指數(shù)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行綜合分析,預(yù)測(cè)HER2/neu的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。采用SYFPEITHI超基序法結(jié)合多項(xiàng)式法,預(yù)測(cè)HER2/neu的HLA-A2及HLA-A24限制性CTL表位。篩選HER2/neu全長(zhǎng)序列中吳氏抗原性

3、指數(shù)較高且相臨近B細(xì)胞和CTL,表位的肽段作為聯(lián)合表位蛋白。
　　 2.選取預(yù)測(cè)的CTL和B細(xì)胞聯(lián)合表位多肽序列,按原核系統(tǒng)偏愛(ài)的氨基酸密碼子優(yōu)化,合成寡核苷酸引物,退火獲得目的基因后克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)多克隆位點(diǎn)內(nèi)。將重組載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21表達(dá)聯(lián)合蛋白,并經(jīng)SDS-PAGE、Western Blot分析鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 1.SOPMA、GOR和HNN三種方法對(duì)HER2/ne

4、u二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)均表明,二級(jí)結(jié)構(gòu)中柔性區(qū)域以無(wú)規(guī)卷曲為主,少見(jiàn)轉(zhuǎn)角。B細(xì)胞表位可能位于其N端30～38,117～124,186～195,245～250,378～388,497～504,601～606,939～943,992～997,1106～1116,1121～1126,1140～1158,1166～1175,1225～1234,1240～1246區(qū)段。CTL表位可能位于106～114,141～149,153～161,369～377,3

5、98～406,411～419,442～450,457～465,460～468,466～474,653～661,654～662,665～673,666～674,799～807,828～836,1093～1101區(qū)段。CTL和B細(xì)胞聯(lián)合表位位于106～125,369～388,456～474,633～662,962～979,1091～1117區(qū)段。
　　 2.經(jīng)酶切、PCR鑒定和核苷酸測(cè)序表明,成功構(gòu)建了3個(gè)編碼B細(xì)胞和CTL聯(lián)合細(xì)胞

6、表位的原核表達(dá)質(zhì)粒,分別命名為:pET32a/HER2-106～125、pET32a/HER2-369～388和pET32a/HER2-962～979。經(jīng)SDS-PAGE分析表明,在37℃1.0mM IPTG作用下誘導(dǎo)5h均能很好地表達(dá)目的蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為20kDa,與預(yù)期Mr大小吻合；蛋白表達(dá)量均約占細(xì)菌總蛋白量的20％左右。經(jīng)WesternBlot結(jié)果顯示單一明顯條帶,與SDS-PAGE中位置吻合。用Ni-NTA樹(shù)脂親

7、和層析法分別純化得到表位聯(lián)合蛋白,分別命名為:HER2-106～125、HER2-369～388和HER2-962～979和pET32a(+)空載體所表達(dá)的His蛋白,純度均達(dá)95％以上。
　　 結(jié)論:
　　 1.預(yù)測(cè)并篩選了3個(gè)可能的HER2/neu B細(xì)胞和CTL聯(lián)合細(xì)胞表位。
　　 2.通過(guò)分子克隆分別成功構(gòu)建了含CTL和B細(xì)胞聯(lián)合表位的重組質(zhì)粒pET32a/HER2-106～125,pET32a/HER2