創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素抗原表位預(yù)測(cè)、鑒定及免疫機(jī)制的探索.pdf

1、目的： 用生物信息軟件預(yù)測(cè)出創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(vibriovulnificuscytolysin)的抗原表位，利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建噬菌體表位肽，篩選出有效抗原表位；并對(duì)創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素表位肽的免疫應(yīng)答機(jī)制進(jìn)行探索，為下一步研制創(chuàng)傷弧菌多抗原肽疫苗(MAP)奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、溶細(xì)胞素T細(xì)胞和B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)采用PropredHLA-DRbindingpeptideprediction-ProPred的預(yù)測(cè)服

2、務(wù)器(http://www.imtech.res.in/raghava/propred/)以及EMBOSS軟件包中ANTIGENIC程序(http://bioinfo.hku.hk/EMBOSS/)、結(jié)合創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(Vvha)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Vvha的T和B細(xì)胞表位，并根據(jù)Swiss-model提供的信息分析Vvha的B細(xì)胞表位的空間結(jié)構(gòu)從而選取聯(lián)合的T，B細(xì)胞表位進(jìn)行研究。 2、重組噬菌體展示肽系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定PCR擴(kuò)增法

3、獲取表位基因片段，分別用Acc65I，EagI酶酶切質(zhì)粒M13KE和表位基因片段，然后分別切膠回收酶切的目的片段，加入合適的T4連接酶，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli2738中。將被轉(zhuǎn)化E.coli.ER2738、IPTG/X-gal、溶化后冷卻至47℃左右頂層瓊脂混勻，傾注于含四環(huán)素(10mg/ml)的LB平板上，37℃培養(yǎng)6h后觀察結(jié)果。將噬菌斑小量培養(yǎng)后為模板，采用檢測(cè)引物(表1)進(jìn)行PCR初步鑒定后測(cè)序。 3

4、、表位的初步篩選及鑒定采用10％分離膠的SDS-PAGE，含不同重組PⅢ蛋白(rPⅢ)噬菌體的上樣量均為1×1012，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察各rPⅢ表達(dá)情況。重組蛋白rVvc兔抗血清為一抗，采用Westernblot對(duì)上述表位肽進(jìn)行初步鑒定。實(shí)驗(yàn)中以無(wú)任何插入片段的等量野生型噬菌體作為對(duì)照。 4、創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素表位肽免疫應(yīng)答機(jī)制的探索小鼠腹腔免疫法測(cè)定各重組噬菌體的抗體效價(jià)；采用CCK-8試劑盒確定重組噬菌體的最佳刺激濃度后，采

5、用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各重組噬菌體免疫后的小鼠CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值、ELISA細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各重組噬菌體免疫后的小鼠IFN-r、IL-2、IL-4、IL-6細(xì)胞因予濃度。 結(jié)果： 1、Vvha表位預(yù)測(cè)結(jié)果及其選擇根據(jù)評(píng)分分?jǐn)?shù)及T細(xì)胞和B細(xì)胞表位重疊情況，選擇Vvha1(194-217)、Vvha2(332-352)、Vvha3(295-314)、Vvha4(62-80)四個(gè)表位，Swiss-model顯示這

6、四個(gè)表位均位于Vvha分子表面。 2、噬菌體展示肽系統(tǒng)的構(gòu)建參照噬菌體展示系統(tǒng)試劑盒說(shuō)明書和分子克隆書，用含四環(huán)素LB液體培養(yǎng)基小量培養(yǎng)有正確插入序列的目的重組噬菌體，PCR反應(yīng)、SDS-page電泳結(jié)果顯示重組的噬菌體中確實(shí)插入了目的表位片段。 3、表位的初步篩選與鑒定SDS-page電泳及Westernblot結(jié)果顯示與野生型M13KE相比，重組的噬菌體中確實(shí)插入了目的表位片段，且M13KE-Vvha2、M13KE-

7、Vvha3、M13KE-Vvha4反應(yīng)強(qiáng)度高于M13KE-Vvha1。 4、表位肽免疫應(yīng)答機(jī)制的探索抗體效價(jià)結(jié)果顯示四個(gè)重組噬菌體表位肽的免疫原性均較高。流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞因子測(cè)定表示重組噬菌體免疫后誘導(dǎo)機(jī)體T淋巴細(xì)胞向Th1、Th2型轉(zhuǎn)化，尤以Th1型轉(zhuǎn)化明顯，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，M13KE-Vvha2、M13KE-Vvha4免疫后機(jī)體在這兩項(xiàng)檢測(cè)中變化相對(duì)高。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功預(yù)測(cè)創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(vibriovul