創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白誘導(dǎo)iNOS表達(dá)及初步機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白(rVvhA)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的體外毒性作用和吞噬功能的影響。
　　2、研究創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白(rVvhA)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的情況;觀察p38MAPK信號(hào)途徑對(duì)rVvhA和IFN-γ協(xié)同誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞NO合成的調(diào)節(jié)作用。
　　3、為探索創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素（vibro vulnificus cytolysi

2、n，VVC）的細(xì)胞毒性分子機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、誘導(dǎo)含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌表達(dá)創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白，應(yīng)用Ni2+親和層析方法對(duì)rVvhA進(jìn)行純化;利用分步稀釋加透析相結(jié)合的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性。
　　2、將復(fù)性純化蛋白作用于小鼠巨噬細(xì)胞（J774A.1、PMΦ），應(yīng)用MTT法、吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)、Griess法和熒光法分別檢測(cè)rVvhA對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用以

3、及刺激細(xì)胞一氧化氮合成、一氧化氮合酶活性的影響;應(yīng)用RT-PCR和免疫熒光法檢測(cè)rVvhA對(duì)小鼠J774A.1細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響。分析p38MAPK抑制劑對(duì)rVvhA誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞NO合成的調(diào)節(jié)，初步評(píng)價(jià)p38MAPK在rVvhA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO合成的信號(hào)通路中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:
　　1、含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌經(jīng)0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的融

4、合蛋白Mr約為54kDa,電泳結(jié)果與該融合蛋白的理論推算值基本相符。表達(dá)蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌后，再經(jīng)Ni2+-NTA柱純化，其純度達(dá)88.0％左右。純化的rVvhA經(jīng)復(fù)性液復(fù)性后，具有溶血活性。
　　2、MTT和中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示rVvhA具有降低小鼠巨噬細(xì)胞的存活率活性和吞噬功能，呈劑量依賴性;以脂多糖與IFN-γ協(xié)同作用作為陽性對(duì)照組，Griess法和熒光法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在IFN-γ或rVvh單獨(dú)作用時(shí)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成低量的N

5、O以及細(xì)胞內(nèi)NOS活性較低，但在IFN-γ存在時(shí)，濃度為1.6 HU/ml和1.2 HU/ml rVvhA分別誘導(dǎo)J774 A.1和PMΦ細(xì)胞24 h后，培養(yǎng)上清液NO濃度達(dá)峰值，且此濃度時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)NOS活性;RT-PCR和免疫熒光法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IFN-γ存在時(shí)，rVvhA增加 J774A.1細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白水平表達(dá)。且p38MAPK抑制可一定程度降低J774A.1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的含量以及細(xì)胞內(nèi)NOS活性。
　

6、　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，rVvhA具有通過干擾素-γ對(duì)信號(hào)依賴途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO合成的生物學(xué)活性。提示rVvhA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO合成增加，這一機(jī)制可能參與rVvhA的細(xì)胞毒性作用，NO可能作為一種生物信使分子和細(xì)胞毒效應(yīng)因子，形成瀑布效應(yīng)，加重病程進(jìn)展。p38MAPK抑制劑可一定程度降低J774A.1細(xì)胞中NO合成和NOS活性，推測(cè)p38MAPK信號(hào)途徑可能參與rVvhA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞合成NO，但與rVvhA作用濃度和細(xì)胞類型有