創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶的基因克隆、蛋白表達(dá)、抗體制備及其致病性研究.pdf

1、目的： 通過(guò)基因工程的方法，建立使vvp及vvhA基因高效表達(dá)的原核表達(dá)系統(tǒng)，從而得到高產(chǎn)量高純度的創(chuàng)傷弧菌金屬蛋白酶和溶細(xì)胞毒素。并在此基礎(chǔ)上制備分別針對(duì)二者的多克隆抗體并初步研究這兩種創(chuàng)傷弧菌胞外產(chǎn)物的具體致病作用及其在感染創(chuàng)傷弧菌機(jī)體中的定位，為揭示VV的致病機(jī)制、臨床VV感染的診治及進(jìn)一步免疫檢測(cè)試劑的研究提供依據(jù)。 方法： 1.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素vvhA基因及金屬蛋白酶vvp基因的體外擴(kuò)增、克隆及序列分

2、析： (1)PCR擴(kuò)增、目的片斷的純化回收及連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α:以VV基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增vvhA、vvp基因的全長(zhǎng)cds片斷；紫外燈下切下含目的片斷的凝膠，應(yīng)用TakaRa的凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；純化回收的目的片斷與T-載體在連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)；CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。 (2)鑒定及序列分析：氨卞抗性篩選后，用質(zhì)粒小提試劑

3、盒對(duì)具有氨卞抗性的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提；以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)PCR陽(yáng)性結(jié)果的重組質(zhì)粒再用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pGEM-T-vvhA和pGEM-T-vvp，并進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析。 2.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素vvhA及金屬蛋白酶vvp重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定： (1)原核表達(dá)載體的構(gòu)建：對(duì)重組質(zhì)粒pGEM-T-vvhA、pGEM-T-vvp及質(zhì)粒

4、pET-32a+用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。切下含有目的片斷的凝膠帶后，進(jìn)行純化回收。vvp、vvhA基因片斷分別與pET-32a+質(zhì)粒酶切片斷在T4連接酶的作用下連接；并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)。 (2)重組質(zhì)粒的篩選和鑒定：用質(zhì)粒小提試劑盒對(duì)具有氨卞抗性的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提；以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定和以BamHI和XhoI雙酶切鑒定后，將兩種重組質(zhì)粒分別命名

5、為pET-32a-vvhA和pET-32a-vvp。以誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物作SDS-PAGE分析，將融合蛋白分別命名為rVVP及rVVC，并以抗6×His組氨酸單克隆抗體為一抗對(duì)融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。 3.溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶重組蛋白的純化及抗原性分析： (1)蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化：對(duì)蛋白表達(dá)可溶性進(jìn)行分析后針對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程中對(duì)工程菌表達(dá)蛋白產(chǎn)生影響的4個(gè)因素：

6、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度以及誘導(dǎo)時(shí)搖菌的轉(zhuǎn)數(shù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀(guān)分析及方差分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)得出的最佳誘導(dǎo)條件組合進(jìn)行驗(yàn)證。 (2)目的蛋白的純化、復(fù)性、濃縮、濃度測(cè)定及抗原性分析：以最佳誘導(dǎo)條件對(duì)重組工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)后，超聲破菌。融合蛋白rVVP及rVVC經(jīng)過(guò)His-Bind親和層析方法獲得純化。純化后的蛋白以透析法進(jìn)行復(fù)性和濃縮。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。以純化

7、后的重組蛋白為抗原，以兔抗創(chuàng)傷弧菌全菌血清為一抗，通過(guò)間接ELISA法及Western-b10t檢測(cè)重組蛋白抗原性。 4.溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶多克隆抗體的制備及溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶致病性的研究： (1)多克隆抗體的制備：將蛋白與佐劑1:1混合后注射新西蘭大白兔，皮下多點(diǎn)注射。用免疫瓊脂雙擴(kuò)散法初步檢測(cè)抗體的滴度，當(dāng)?shù)味冗_(dá)到1:16后。頸動(dòng)脈放血，提取血清，并對(duì)免疫血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定及特異性檢測(cè)；根據(jù)抗血清特異性檢測(cè)結(jié)果

8、，對(duì)多抗血清進(jìn)行吸收純化，得到多克隆抗體。 (2)溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶致病性的研究：昆明小鼠36只，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成6組，每組6只，分別為溶細(xì)胞毒素注射組、金屬蛋白酶注射組、溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶聯(lián)合注射組、VV活菌注射組及對(duì)照1組、對(duì)照2組。VV活菌注射組腹腔注射VV菌液；對(duì)照1組腹腔注射等量的滅菌的Marinebroth2216培養(yǎng)基；溶細(xì)胞毒素注射組及金屬蛋白酶注射組小鼠分別注射前述純化復(fù)性的rWC及rVVP，聯(lián)

9、合注射組小鼠注射rVVC和rVVP的混合液；對(duì)照2組尾靜脈注射等量的滅菌的透析液。隨后對(duì)小鼠一般情況進(jìn)行觀(guān)察及臟器組織的VV分離鑒定和病理學(xué)觀(guān)察，以確定溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶對(duì)各臟器組織的致病性；以所制備的多克隆抗體為一抗免疫組化法檢測(cè)組織中創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素和金屬蛋白酶的分布情況。 結(jié)果： 1.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素vvhA基因及金屬蛋白酶vvp基因的體外擴(kuò)增、T-A克隆及序列分析： 從VvATCC27562株DN

10、A模板中擴(kuò)增whA基因及vvp基因cds全長(zhǎng)，均獲得與預(yù)期大小相符合的目的條帶。經(jīng)過(guò)T-A克隆得到重組質(zhì)粒pGEM-T-whA和pGEM-T-vvp，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序、序列分析及比對(duì)：vvp基因cds全長(zhǎng)1830bp，A、T含量分別為25.96％和24.54％，(G+c)含量占49.5％。其核苷酸序列與創(chuàng)傷弧菌E86株的vvp基因序列(GeneBankNo.DQ923325)比較，同源性為99％，有17處點(diǎn)突變。其中15處為同義突變；2處為

11、錯(cuò)義突變；vvhA基因cds全長(zhǎng)1356bp，A、T含量分別為27.65％和23.89％，(G+C)含量占48.45％。其核苷酸序列與創(chuàng)傷弧菌CDCB3547株的vvhA基因序列(GeneBankNo.AB124803.1)比較，同源性為99％，有9處點(diǎn)突變并且均為同義突變。 2.創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素vvhA及金屬蛋白酶vvp重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定： 表達(dá)載體pET-32a-vvhA及pET-32a-vvp轉(zhuǎn)化大腸桿菌B

12、L21(DE3)后，經(jīng)IPT6誘導(dǎo)，均能表達(dá)融合蛋白。Western-blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物rWC及rWP均能與抗6×His組氨酸單克隆抗體特異性結(jié)合，這一結(jié)果也證實(shí)所構(gòu)建的兩種原核表達(dá)系統(tǒng)均能表達(dá)融合6×His組氨酸的蛋白。 3.溶細(xì)胞毒素金屬蛋白酶重組蛋白的純化及抗原性分析： 基于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化融合蛋白的表達(dá)條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直觀(guān)分析及方差分析均表明：各因素對(duì)rVVP表達(dá)的重要性依次為誘導(dǎo)搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘

13、導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度。本實(shí)驗(yàn)的最佳組合誘導(dǎo)條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)溫度37℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度1mol/L；而各因素對(duì)rVVC表達(dá)的重要性依次為誘導(dǎo)時(shí)間、搖菌轉(zhuǎn)數(shù)、誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度。本實(shí)驗(yàn)的最佳搭配誘導(dǎo)條件為搖菌轉(zhuǎn)數(shù)250r/m、誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)溫度30℃、誘導(dǎo)劑IPTG濃度1mmol/L。在各自?xún)?yōu)化的誘導(dǎo)條件下兩種蛋白均能高效表達(dá)，蛋白表達(dá)量分別達(dá)到了40.67％(rVYP)及58

14、.27％(rWC)。通過(guò)親和層析的方法可以獲得較純的蛋白，并且兩種蛋白都具有良好的抗原性。 4.溶細(xì)胞毒素WC及金屬蛋白酶YVP多克隆抗體的制備及其致病性研究： (1)多克隆抗體的效價(jià)及特異性檢測(cè)：吸收純化后的溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶多克隆抗體分別與相應(yīng)的溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶均能很好地特異性結(jié)合，且與多種常見(jiàn)細(xì)菌菌體無(wú)交叉反應(yīng)；兩種抗體的效價(jià)均達(dá)到了l：12800。 (2)腹腔注射Vv致小鼠感染后致小鼠多臟器損傷

15、，尤以肺、肝臟、腎臟的損傷最為嚴(yán)重。肺和腎臟的損傷均以出血性病變?yōu)橹鳎闻K的損傷表現(xiàn)為肝細(xì)胞廣泛的水腫、氣球樣變性。 (3)溶細(xì)胞毒素及金屬蛋白酶對(duì)小鼠各臟器組織的致病性觀(guān)察：溶細(xì)胞毒素可導(dǎo)致小鼠肺臟的損傷，且與腹腔注射Vv致小鼠感染后肺損傷相似，以出血性病變?yōu)橹?。而金屬蛋白酶未?duì)小鼠的各臟器組織造成明顯損傷。溶細(xì)胞毒素聯(lián)合金屬蛋白酶作用導(dǎo)致的小鼠肺損傷與溶細(xì)胞毒素單獨(dú)作用沒(méi)有差別。 (4)免疫組化檢測(cè)結(jié)果：溶細(xì)胞毒素

16、注射組、聯(lián)合注射組及Vv活菌注射組小鼠肺組織中均檢測(cè)到了溶細(xì)胞毒素的分布：主要分布于肺支氣管上皮、肺泡上皮；以兔免疫前血清作為一抗的陰性對(duì)照組肺組織，肺支氣管上皮及肺泡上皮均為陰性結(jié)果；肝臟和腎組織中未見(jiàn)溶細(xì)胞毒素分布。而金屬蛋白酶注射組、聯(lián)合注射及Vv活菌注射組小鼠的各主要臟器組織中均未檢測(cè)到金屬蛋白酶的分布。 結(jié)論： 1.證實(shí)了vvp基因及vvhA基因均在創(chuàng)傷弧菌的不同菌株之間具有高度的保守性。 2.構(gòu)建了創(chuàng)

17、傷弧菌vvp基因及vvhA基因高效原核表達(dá)系統(tǒng)，得到了高純度有活性的重組蛋白rVVP和rVVC；兩種蛋白均具有良好的免疫原性，為創(chuàng)傷弧菌致病機(jī)制的研究及創(chuàng)傷弧菌免疫檢測(cè)試劑盒及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。 3.成功制備了特異性較好的抗Vv溶細(xì)胞毒素多克隆抗體及抗Vv金屬蛋白酶多克隆抗體。 4.首次證實(shí)創(chuàng)傷弧菌感染機(jī)體時(shí)，溶細(xì)胞毒素對(duì)其毒性的產(chǎn)生是必須的，溶細(xì)胞毒素可獨(dú)立發(fā)揮作用對(duì)機(jī)體造成損傷；發(fā)現(xiàn)肺臟是創(chuàng)傷弧菌感染機(jī)體時(shí)其毒力