創(chuàng)傷弧菌溶細胞素致凋亡肽功能模序預測及其功能的鑒定.pdf

1、目的：
　　 通過計算機輔助軟件及相關數(shù)據(jù)庫等生物信息學技術與手段預測重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(recombinant Vibriovulnificushemolysin，rVvhA)中可能存在的致凋亡肽功能模序，并利用原核克隆技術構建這一功能模序融合基因的原核表達載體。分離純化克隆的融合蛋白，并對其進行蛋白質(zhì)復性。通過作用于細胞等方法鑒定復性得到的融合蛋白的功能活性，進一步完善對天然創(chuàng)傷弧菌溶細胞素(Vibriovulnificu

2、scytolysin,VVC)結(jié)構功能的研究，開發(fā)出新型的致凋亡肽，并以此為基礎為改造該毒素的新藥開發(fā)提供科學依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、功能模序的預測及其原核克隆
　　 利用生物信息學技術與方法對天然創(chuàng)傷弧菌溶細胞素進行結(jié)構和功能的預測。利用BLAST、motifscan、SMART、motifgenome、expasy、SWISS-MODEL等生物數(shù)據(jù)庫及anthepro等生物信息軟件分別對該蛋白質(zhì)的核酸

3、序列和氨基酸序列進行motif預測及其二級、三級結(jié)構的比對分析，分析其中是否含有致凋亡肽模序。致凋亡肽融合基因的原核克?。阂院琾ET-28a+)-rVvhA中的rVvhA基因為模板，設計合適的引物進行PCR擴增出目的基因，將目的基因亞克隆入pET-28a(+)表達質(zhì)粒中，再進一步轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)中，限制性內(nèi)切酶雙酶切及測序鑒定轉(zhuǎn)化成功后的質(zhì)粒其序列是否正確。
　　 二、重組表達載體的誘導表達及融合蛋白的復性與

4、純化
　　 將已成功構建好的菌種IPTG誘導其表達，應用三步洗滌法結(jié)合Ni2+親和層析方法對得到的目的蛋白進行分離純化，通利用稀釋復性法與分步透析相結(jié)合的方法進行蛋白質(zhì)復性，SDS-PAGE鑒定得到的蛋白是否正確。
　　 三、蛋白質(zhì)活性功能檢測
　　 分別利用CCK-8法、ELISA法及激光共聚焦顯微鏡觀察等方法和儀器對得到的重組蛋白的生物學活性進行鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 一、通過利用生物信息

5、學技術預測到創(chuàng)傷弧菌溶細胞素中含有致凋亡肽模序，該模序與蓖麻毒素B鏈的氨基酸序列有較高的同源性，可能具有與蓖麻毒素類似的蛋白功能活性，尤其是與蓖麻毒素B鏈具有更相似的活性。利用這一點，將rVvhA上相應的氨基酸序列逆轉(zhuǎn)換成對應的核酸序列，得到399bp核酸序列。
　　 對該核酸序列進行原核克隆，設計引物，將其重組入pET-28a(+)表達載體中，得到原核表達系統(tǒng)pET-28a(+)-rRicinB?？寺〉玫降墓こ叹鶨.coliB

6、L21(DE3)雙酶切及測序鑒定結(jié)果均表明這一系統(tǒng)與預期設計相同，載體構建成功。
　　 二、含pET-28a+)-rRicinB重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株經(jīng)0.5mmol/LIPTG誘導表達后可在21kDa處得到特異性條帶，SDS-PAGE結(jié)果與該融合蛋白的理論推算值基本相符。表達的蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌與Ni2+-NTA柱親和層析法純化后，得到較為純凈的蛋白質(zhì)溶液，該溶液再通過稀釋復性與分步透析相結(jié)合的方法進行復性

7、，透析完后的蛋白質(zhì)溶液進行冷凍干燥，SDS-PAGE鑒定純化效果良好。
　　 三、體外作用融合蛋白質(zhì)于Hela細胞，CCK-8法檢測其細胞毒性，發(fā)現(xiàn)其具有致細胞凋亡或壞死的功能，50％細胞存活率的濃度為1.323μg/mL;FITC標記蛋白，標記好的蛋白作用Hela細胞，4h后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其能結(jié)合到細胞膜上，且在作用時間較長后該蛋白會進入細胞的細胞質(zhì)中；ELISA法檢測出其具有蓖麻毒素的活性。將細胞置于2.64

8、6μg/mL濃度的蛋白溶液作用4h后通過AnnexinV-FITC/PI熒光雙染進行細胞凋亡現(xiàn)象觀察與檢測，發(fā)現(xiàn)在該濃度下細胞出現(xiàn)了凋亡或壞死現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗利用生物信息學技術與手段預測到了VVC中含有致凋亡肽模序，并成功地對這段模序的核酸序列進行原核克隆，構建得到pET-28a(+)-rRicinB表達系統(tǒng)，分離純化且成功復性得到具有生物學活性的融合蛋白rRicinB。經(jīng)過一系列生物學活性功能鑒定，發(fā)