創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素基因vvhA原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其蛋白質(zhì)致炎、應(yīng)激作用的初探.pdf

1、構(gòu)建pET28a(+)-vvhA融合基因原核表達(dá)載體,分離純化融合蛋白VVC,并對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性和多克隆抗體制備.觀察經(jīng)有活性的融合蛋白VVC作用肝癌細(xì)胞后,肝癌細(xì)胞的TNF-α、HSP90和IL-10因子的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究其生物物學(xué)作用奠定基礎(chǔ). 方法：1、pET28a(+)-vvhA融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與純化利用PCR方法,以含vvhA基因的克隆質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增融合基因vvhA并將其亞克隆入原核表達(dá)載體p

2、ET28a(+)中,構(gòu)建成表達(dá)載體pET28a(+)-vvhA,限制性內(nèi)切酶雙酶切和測(cè)序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建是否正確.將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)其表達(dá),SDS-PAGE和免疫印跡分析表達(dá)產(chǎn)物.將以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì),用洗滌液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ進(jìn)行洗滌后,以Ni-NTA親合層析法純化VVC融合蛋白,SDS-PAGE和免疫印跡分析純化產(chǎn)物.2、VVC融合蛋白的復(fù)性和多克隆抗體的制備將純化目的蛋白分別用PBS液透析復(fù)性、

3、柱上復(fù)性和加入不同濃度的鹽酸胍、鹽離子、助溶劑、氧化還原電勢(shì)、沉淀劑、離子鰲合劑和不同濃度的緩沖液組成的16種不同復(fù)性液進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性對(duì)比.選出幾種復(fù)性率較高的復(fù)性方法.利用復(fù)性純化蛋白質(zhì)作用新鮮兔紅細(xì)胞懸液,觀察細(xì)胞溶血情況來(lái)評(píng)價(jià)復(fù)性效果.用純化目的蛋白免疫日本大耳兔制備多克隆抗體,免疫印跡分析重組蛋白的免疫原性并用ELISA檢測(cè)多克隆抗體的效價(jià).3、體外實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)性純化蛋白的生物學(xué)活性進(jìn)行初探將復(fù)性純化蛋白作用于Hep2細(xì)胞,觀察細(xì)胞

4、的損傷情況,進(jìn)一步印證復(fù)性效果.作用于人肝癌細(xì)胞株(SMMC7721),利用RT-PCR方法,檢測(cè)TNF-α、HSP90、IL-10 mRNA動(dòng)態(tài)變化,來(lái)初步評(píng)價(jià)VVC融合蛋白的生物學(xué)活性. 結(jié)果： 1、原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與純化雙酶切及測(cè)序結(jié)果表明原核表達(dá)載體pET28a(+)-vvhA與設(shè)計(jì)相符.工程菌BL21 DE3<'Pet28(a+)-vvhA>誘導(dǎo)表達(dá)后可在54Kda處產(chǎn)生特異性表達(dá)條帶,能被抗His<,

5、6>單克隆抗體特異性識(shí)別.表達(dá)蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌后,再經(jīng)Ni-NTA柱純化,其純度達(dá)96﹪以上.免疫印跡分析表明,純化后的蛋白能被抗His<,6>單克隆抗體特異性識(shí)別. 2、VVC融合蛋白的復(fù)性和多克隆抗體的制備純化的重組蛋白包涵體經(jīng)16種不同復(fù)性液復(fù)性,均不同程度得到復(fù)性.其復(fù)性率最高可接近20﹪.同時(shí)重組蛋白包涵體利用PBS液進(jìn)行復(fù)性得率卻極低,但利用純化柱進(jìn)行柱上復(fù)性,其復(fù)性率卻高達(dá)97﹪以上.免疫印跡分析證實(shí),兔抗VVC融

6、合蛋白多克隆抗體能與重組蛋白發(fā)牛特異性反應(yīng),ELISA檢測(cè)其效價(jià)為1:25 600. 3、體外實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)性純化蛋白生物牛物學(xué)活性進(jìn)行初探細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兔抗VVC融合蛋白多克隆抗體能明顯阻斷VVC融合蛋白損傷細(xì)胞作用.TNF-α、HSP90和IL-10 mRNA結(jié)果顯示,VVC融合蛋白能明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(SMMC7721)上調(diào)TNF-α、HSP90和下調(diào)IL-10分泌的能力,但具有時(shí)間和劑量依賴性. 結(jié)論：