Thanatin-PPA融合蛋白的表達(dá)和特性研究.pdf

1、掌葉半夏凝集素(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)是一種從掌葉半夏(Pinellia pedatisecta Schott)塊莖中提取并能夠特異性凝集甘露糖的蛋白,屬于單子葉植物凝集素家族。研究表明,掌葉半夏凝集素具有植物保護(hù)、抗腫瘤等功效?？咕?Protegrin)是生物體內(nèi)的一種具有抗菌活性的內(nèi)生免疫原性動物蛋白。死亡素(Thanatin)是在昆蟲斑腹刺益蝽(Podisus maculiven

2、tris)中發(fā)現(xiàn),由21個氨基酸殘基組成的抗菌肽,研究表明死亡素對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和某些真菌都有抑制作用。
　　 腫瘤細(xì)胞的研究表明,糖鏈在合成水平上的差異和特殊糖基結(jié)構(gòu)同腫瘤細(xì)胞的侵染具有相關(guān)性,并且掌葉半夏凝集素的融合表達(dá)具有識別甘露糖表型的實體腫瘤細(xì)胞表面的糖抗原;并且已經(jīng)從分子水平證實了大部分慢性疾病都是由炎癥反應(yīng)失調(diào)引起的,具有抗菌活性的藥物可能抑制癌癥的發(fā)病或者治療癌癥?；谝陨蟽牲c,本文設(shè)計了Thanat

3、in-PPA的融合蛋白,分別保留了掌葉半夏凝集素抗腫瘤活性和死亡素抗菌活性,并且融合蛋白表達(dá)時,為了避免融合蛋白表達(dá)時影響蛋白高級結(jié)構(gòu)的正確折疊以及蛋白的活性,在兩個蛋白之間引入10個氨基酸殘基的柔性肽。
　　 本文首先通過從掌葉半夏塊莖中提取總RNA,設(shè)計引物克隆編碼掌葉半夏凝集素的基因ppa;通過重疊PCR分別將編碼柔性肽基因和死亡素基因融合到ppa5'端,得到編碼融合蛋白的基因ppa-linker-thanatin。融合基

4、因經(jīng)測序分析顯示克隆成功。
　　 本文將融合基因連接到pET32a表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)酶切鑒定和測序分析,然后轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。融合蛋白分子量為32kDa且主要表達(dá)在包涵體中,包涵體經(jīng)洗滌、稀釋復(fù)性和純化,用于后續(xù)實驗。
　　 本文構(gòu)建酵母表達(dá)載體pPIC3.5K-pt,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測序分析顯示構(gòu)建成功。pPIC3.5K-pt經(jīng)S

5、alI單酶切線性化后電轉(zhuǎn)插入到畢赤酵母菌株GS115染色體中。pPIC3.5K/pt在表達(dá)培養(yǎng)基中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá),蛋白經(jīng)Ni柱純化后顯示為31kDa左右的單一條帶。
　　 本文進(jìn)行了原核表達(dá)蛋白的凝血活性、抗菌活性和體外抗腫瘤活性的分析。融合蛋白在表達(dá)過程中抑制宿主細(xì)菌的生長;以半夏新鮮蛋白為對照的凝血活性顯示融合蛋白具有凝集兔血紅細(xì)胞的作用,但凝集活性有一定的降低;體外MTT顯示融合蛋白具有顯著的抑制Hela、Beas-2B、