來源于極端嗜熱細(xì)菌的Ⅱ型抗草甘膦EPSPS的性質(zhì)及高效表達(dá).pdf

1、上 海 海 洋 大 學(xué)碩 士 學(xué) 位 論 文題 目 ： 目 ： 來源于極端嗜熱細(xì)菌的Ⅱ型抗草甘膦 EPSPS的性質(zhì)及高效表達(dá)英文題目： 英文題目： Characterization and high expression of class II5-enopyruvylshikimate-3-phosphate synthasewith tolerance to glyphosate form Thermusthermophilus專 業(yè)

2、： 業(yè)： 生物學(xué)研究方向： 研究方向： 生物化學(xué)與分子生物學(xué)姓 名： 名： 孫百慧指導(dǎo)教師： 指導(dǎo)教師： 姚泉洪二 O 一六年六月五日學(xué) 校 代 碼 ： 10264研究生學(xué)號(hào)： M130209532上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文2中文摘要 中文摘要草甘膦是非常優(yōu)秀的除草劑， 除草劑草甘膦屬于典型的有機(jī)磷類除草劑。 草甘膦在作用過程中，其作用靶標(biāo)是植物體內(nèi)的 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPs） 。草甘膦對(duì)植物的作用機(jī)理主要是與磷

3、酸烯醇式丙酮酸（PEP）之間產(chǎn)生的競(jìng)爭性抑制作用，從而阻截了植物體內(nèi) EPSP 合成酶的活性，致使植物體內(nèi)莽草酸的大量累積和貯存，阻止了植物體內(nèi)芳香族氨基酸這類化合物的合成，同樣也抑制了植物的生長和發(fā)育， 最終將植物殺死。 草甘膦以其獨(dú)特有效的作用方式，至今為止仍為全世界銷量最高的除草劑品種。草甘膦大規(guī)模大面積的使用在很大程度上促進(jìn)了抗草甘膦農(nóng)作物培育種植的興起。借助于基因工程的方法，能使草甘膦工業(yè)化生產(chǎn)得到更好的發(fā)展。決定具有草甘膦抗

4、性的特殊基因，是由 aroA 基因決定的，這個(gè)基因可以編碼合成EPSP 合成酶。 到目前為止， 最為常用有效的方法是從農(nóng)桿菌 （Agrcbacterium spp.）菌系 CP4 中，研究并克隆得到對(duì)草甘膦具有抗性的基因，再把得到的目的基因?qū)氲街参矬w內(nèi)，就可以得到具有對(duì)草甘膦有抗性的作物（抗草甘膦作物） ?，F(xiàn)階段的農(nóng)業(yè)市場(chǎng)中出現(xiàn)的抗草甘膦作物，絕大部分都是轉(zhuǎn)有 CP4 基因的抗草甘膦作物。本文首先根據(jù) Thermus thermoph

5、ilus 的 EPSP 合成酶的蛋白序列和合理的設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)出新的 EPSP 合成酶基因的核苷酸序列。然后再根據(jù)該核苷酸序列繼續(xù)設(shè)計(jì)出一系列引物， 從而來合成我們所需要的目的基因。 利用 PTDS (兩步 PCR )合成法可以快速高效地將來源于極端嗜熱細(xì)菌 （Thermus thermophilus） 的野生型TTAROA 基因通過合成，成為能夠在異源的大腸桿菌中高效表達(dá)的新型 EPSP 合成酶基因 TtaroAS。將合成好的基因通過大腸

6、桿菌完成克隆并進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示出設(shè)計(jì)的基因序列與野生型的基因序列完全達(dá)成一致。 新的 EPSP 合成酶基因與野生型基因之間的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果顯示出 74.9 %的相似性。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶[5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase(EPSPS)]是莽草酸途徑中重要的合成酶， 這種酶可以調(diào)節(jié)在植物體內(nèi)和微生物中芳香族化合物的合成。 通過進(jìn)化分析證實(shí)該酶屬于Ⅱ型 EPSP