來源于嗜熱真菌Neosartorya fischeri P1的三個聚半乳糖醛酸酶的基因克隆、異源表達及性質(zhì)研究.pdf

1、果膠類物質(zhì)是非淀粉多糖重要組成成分之一，主要分布在植物細胞壁的中膠層中，由不同酯化度的多聚半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵聚合而成。果膠類物質(zhì)雖然不能直接向動物體提供能源，但是它有很好的益生作用，可以影響很多物質(zhì)的代謝。果膠類物質(zhì)也是重要的可再生資源，其降解的半乳糖醛酸寡糖產(chǎn)物具有高利用價值。
　　果膠酶是降解果膠類物質(zhì)的一類復合酶的總稱。按照降解底物、作用方式等可以將果膠酶分為三類:通過水分子的參與攻擊α-1，4糖苷鍵的聚半乳糖醛酸

2、酶，通過反式消去作用斷裂糖苷鍵的果膠裂解酶以及可以降解酯化果膠的果膠酯酶。果膠酶具有廣闊的應用前景，可以應用于食品、紡織、飼料、造紙等行業(yè)，因此發(fā)掘更多的具有不同優(yōu)良性質(zhì)的果膠酶具有重要的意義。
　　本論文從嗜熱真菌Neosartorya fischeri P1中克隆獲得了一個內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶基因(Nfpg5)以及兩個外切聚半乳糖醛酸酶基因(Nfpg4和Nfpg6)。為驗證其生物學功能，分別構(gòu)建了重組表達載體，并成功在畢赤酵母中

3、表達。NfPG4的氨基酸推導序列與來源于N.fischeri NRRL181的XM_001257488.1序列一致性為97.6％，與已完成性質(zhì)測定的Aspergillus tubingensi外切聚半乳糖醛酸酶序列最高一致性為79％。重組酶NfPG4，最適溫度65℃，在55℃條件下處理1h可以保持穩(wěn)定;最適pH3.5，在pH3.0-8.5范圍內(nèi)，37℃處理1h表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。Km值為2.9 mg/ml，kcat為720 s-1，比活為

4、700.9 U/mg。NfPG5的氨基酸推導序列與N.fischeri NRRL181的XM_001264034.1序列一致性為100％，與已報導且經(jīng)過性質(zhì)測定的Achaetomium sp.Xz-8內(nèi)切聚半乳糖醛酸酶序列最高一致性為58％。重組酶NfPG5的最適溫度為70℃，在55℃條件下處理1h可以保持穩(wěn)定;最適pH4.5，在pH2.0-11.0范圍內(nèi)，37℃處理1h表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。Km值為1.0 mg/ml，kcat為2854

5、s-1，比活為3630.4 U/mg。NfPG6的氨基酸推導序列與N.fischeriNRRL181的XM_001263571.1序列一致性為100％。重組酶NfPG6，最適溫度55℃，在50℃條件下處理1h可以保持穩(wěn)定;最適pH4.5，NfPG6在pH2.0-11.0范圍內(nèi)，37℃處理1h表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。Km值為3.4 mg/ml，kcat為724 s-1，比活為53.9 U/mg。
　　綜上所述，本論文通過基因克隆的方法從嗜