重組真菌細(xì)胞色素P450nor的表達(dá)純化及SPR免疫檢測法的建立.pdf

1、該研究將已克隆的真菌細(xì)胞色素P450nor基因插入原核表達(dá)質(zhì)粒載體pRSET和pET28的BamHI/Hind Ⅲ位點(diǎn),成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pRT- p450nor和pET- p450nor,并轉(zhuǎn)化到EcoliBL21.為了提高重組蛋白的表達(dá)量,對誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)的溫度及IPTG的濃度進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果表明:最佳誘導(dǎo)溫度為30℃,而IPTG的濃度變化對重組蛋白的表達(dá)量影響不大.確定誘導(dǎo)條件為30℃誘導(dǎo),IPTG濃度為1mmol/L.重組表達(dá)質(zhì)粒p

2、RT- p450nor和pET- p450nor經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,在EcoliBL21中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá),SDS- pAGE分析顯示表達(dá)產(chǎn)物的分子量為44KD.在此條件下,大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)重組細(xì)胞色素P450nor,經(jīng)DEAE纖維素色譜柱純化,SDS- pAGE分析表明,純化的目的蛋白基本上為單一譜帶,純化達(dá)到預(yù)期效果.利用表面等離子模共振技術(shù)(SPR)進(jìn)行生物特異性相互作用分析(BIA )己成為現(xiàn)代基因工程技術(shù)中的一種先進(jìn)的手段.與傳統(tǒng)的

3、研究方法如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA )相比,它具有方便快捷、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、實(shí)時(shí)監(jiān)控等多項(xiàng)特點(diǎn).利用這種新型研究手段對于生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷以及治療等方面有著十分重要的意義.SPR生物傳感器的高靈敏性,以及生物大分子間反應(yīng)的高度特異性,使不需要嚴(yán)格純化而直接檢測目的蛋白與抗體間的反應(yīng)成為可能.我們引入這項(xiàng)技術(shù),利用自組裝的SPR生物傳感器,以乙肝表面抗原為樣品,建立和優(yōu)化這種檢測方法,探討檢測過程中的種種影響因素,為檢