蓖麻毒素免疫檢測方法的建立及RTB的融合表達(dá)與抗原性分析.pdf

1、蓖麻毒素(RT)是一種核糖體失活蛋白,由A、B鏈組成,小鼠LD50僅為7-10μg/kg。目前國內(nèi)外對蓖麻毒素的研究多為用于抗腫瘤的免疫毒素的制備以及中毒機理的研究,由于蓖麻毒素的毒性高,從攝入到死亡僅需1～2h,致死量極小,感官無法辨認(rèn),蓖麻毒素類毒素和抗毒素正在研究中,目前尚無用于人的特效藥,因此,蓖麻毒素的快速檢測,特別是在被人體攝入之前就能夠高效靈敏的檢測到,就顯的極為重要。 本試驗將制備的抗蓖麻毒素腹水單抗純化后進(jìn)行抗

2、原表位的分析,結(jié)果顯示4D8、4D12、1H4三株單抗的抗原決定簇均位于蓖麻毒素A鏈上。對4D8標(biāo)記了辣根過氧化物酶和FITC,基于表面等離子共振儀與流式細(xì)胞儀分析后,分別建立了夾心ELISA、IMS-ELISA、SPR與液態(tài)芯片檢測蓖麻毒素的方法。 1.夾心ELISA檢測蓖麻毒素方法的最佳條件為：45ug/ml抗RT的多克隆抗體為捕獲抗體、1:4000倍稀釋的HRP-4D8為檢測抗體、5％脫脂乳+2％PEG20000為封閉劑,

3、洗去檢測抗體后用TMB在37℃下顯色20min,測定OD450;該方法不跟與蓖麻毒素結(jié)構(gòu)相近的其它幾種毒素發(fā)生交叉反應(yīng),最低檢出濃度為5ng/ml,線性范圍為0.1-1ug/ml,對純凈水的回收率為107.6％。 2.IMS-ELISA檢測蓖麻毒素方法的最佳條件為：將多抗與磁珠偶連并封閉后用PBST緩沖液懸浮在EP管中,加入抗原后37℃輕微振蕩孵育1h,每15min吹打重懸一次,清洗后加入4000倍稀釋的HRP-4D8檢測抗體2

4、00μl孵育,清洗后加TMB底物在37℃下顯色20min,測定OD450;該方法不跟與蓖麻毒素結(jié)構(gòu)相近的其它幾種毒素發(fā)生交叉反應(yīng),最低檢出濃度為50ng/ml,當(dāng)RT濃度介于0.2-10ug/ml之間時,呈現(xiàn)極好的線性關(guān)系,對純凈水、秋梨膏、純牛奶的回收率分別為95％、93％、68％。 3.由SPR動力學(xué)分析了四株抗蓖麻毒素單抗的親和性：并建立了SPR檢測蓖麻毒素與相思子毒素的SPR檢測方法,對蓖麻毒素的線性范圍為0-2000n

5、g/ml之間,最低檢出濃度為0.05ng/ml,對相思子毒素的線性范圍為250ng/ml-2000ng/ml,最低檢出濃度為0.5ng/ml。對兩種毒素的混合物同時檢測時與單獨檢測的效果一樣。 4.本研究同時基于流式細(xì)胞儀與微球載體建立了對蓖麻毒素的檢測方法,對蓖麻毒素的線性范圍為10-1000ng/ml之間,最低檢出濃度小于0.1ng/ml。 5.采用PCR法擴增出蓖麻毒素B鏈基因,并將其與pMD18-T克隆載體相連接