DON毒素和脫二氧喹烯酮抗體制備及免疫檢測方法建立.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素(DON毒素)在自然界中存在廣泛，由真菌產(chǎn)生。主要污染谷物、食品、飼料等，對人類的危害十分嚴(yán)重。因此，建立一種快速、靈敏的檢測方法檢測毒素的含量是非常有必要的。喹烯酮雖然屬高效、安全的飼料添加劑，但該藥物作為獸藥使用，仍需考慮其通過食物鏈作用對人體可能會(huì)產(chǎn)生不良影響，所以也需要建立其食用動(dòng)物組織殘留量檢測方法并進(jìn)一步確定其殘留限量。脫二氧喹烯酮(Desoxyquinocetone，DQCT)是喹烯酮在動(dòng)物體內(nèi)的主要

2、代謝產(chǎn)物。本研究是將脫二氧喹烯酮作為喹烯酮的殘留標(biāo)志物進(jìn)行藥物的殘留研究。本論文旨在建立檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和脫二氧喹烯酮的酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測方法。
　　 本論文利用碳二亞胺(CDI)法合成了DON毒素的免疫原DON-MBSA，采用4-二甲氨基吡啶(DMAP)催化法，成功將DON的三個(gè)羥基位點(diǎn)乙?；?，與載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，合成了包被原DON-HS-KLH。免疫小鼠后獲得了多克隆抗體，建立了DON毒素

3、的間接競爭ELISA方法。該方法的IC50為1.05μg/mL，線性范圍為0.01μg/mL-100μg/mL。本實(shí)驗(yàn)是在本實(shí)驗(yàn)室原來合成人工抗原的基礎(chǔ)上，改變了免疫原的合成方法，使抑制實(shí)驗(yàn)得到較好改善。
　　 本論文采用混合酸酐法和碳二亞胺法成功合成了喹烯酮?dú)埩魳?biāo)志物脫二氧喹烯酮的免疫原DQCT-MBSA和包被原DQCT-OVA。用過碘酸鈉氧化法將DQCT-OVA與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)，合成了酶標(biāo)抗原DQCT-OVA-

4、HRP。用DQCT-BSA免疫小鼠后獲得了高效價(jià)的多克隆抗體，取脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)四次篩選和克隆，得到了2株能穩(wěn)定分泌抗DQCT抗體的單克隆細(xì)胞株(1A6，9E10)，并制備單克隆抗體腹水，將腹水用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化。經(jīng)檢測，1A6、9E10的抗體類型均為IgG2a，其輕鏈為κ鏈。腹水效價(jià)為1:128000。建立了DQCT的直接競爭ELISA檢測方法，該方法的IC50為38.02μg/mL，以IC20-IC8