T-2毒素和脫二氧喹賽多免疫學(xué)檢測方法的研究.pdf

1、T-2毒素是由鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物中毒性較強的一種真菌毒素，是最常見的污染糧食類作物的幾種主要毒素之一。由于其毒性比較大且廣泛分布于自然界，對人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了極大危害，故建立一種高效、快速、靈敏的檢測方法來檢測其含量是非常有必要的。喹賽多雖然曾被當作安全、高效的飼料添加劑來使用，但考慮到其通過食物鏈累積作用對人體可能產(chǎn)生的不良影響，所以也需要建立相應(yīng)的檢測方法來監(jiān)測其在食用動物組織中的殘留量。因脫二氧喹賽多被確定為喹賽多

2、在動物體內(nèi)代謝的殘留標志物，本研究就是以此為基礎(chǔ)對喹賽多進行藥物的殘留研究。本論文旨在建立檢測T-2毒素的抗體芯片免疫分析法和檢測脫二氧喹賽多的化學(xué)發(fā)光免疫分析法。
　　 ①在合成檢測抗原T-2-HS-BSA后，使用微量點樣毛細管將其點陣于瓊脂糖修飾的基片上，使用Cy5標記的二抗，建立間接競爭抗體芯片免疫分析法，用于檢測T-2毒素在小麥等糧食作物中的殘留。本研究在優(yōu)化點樣濃度、單抗工作濃度、封阻物質(zhì)及濃度和熒光二抗工作濃度后建立

3、了標準曲線，其檢測范圍(IC20～IC80)為0.005 ng/mL～9.58 ng/mL，半抑制濃度(IC50)為0.22 ng/mL，最低檢測限(LOD)為0.001 ng/mL。同時初步建立間接競爭酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)標準曲線，其檢測范圍為0.27 ng/mL～11.82 ng/mL，IC50為1.77 ng/mL，LOD為0.14 ng/mL。兩者相比，抗體芯片檢測法最低檢測限降低了2個數(shù)量級和檢測范圍加大了2個數(shù)量級。

4、在此基礎(chǔ)上進行加標回收實驗，并運用ELISA、抗體芯片和高效液相色譜法(HPLC)三種方法對加標樣品進行了檢測，回收率基本達到分析檢測的要求。該方法簡單、快速、高靈敏度、高通量、上樣量小，適用于糧食作物中真菌毒素殘留監(jiān)測。
　　 ②采用魯米諾-過氧化氫發(fā)光系統(tǒng)，使用HRP標記的二抗，建立了間接競爭酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光免疫分析法，用于檢測脫二氧喹賽多(Cy4)在肉雞胸肌及肝臟組織中的殘留。首先使用Cy4多克隆抗體初步摸索并建立化學(xué)發(fā)光檢測

5、標準曲線，其檢測范圍為0.017～10.34μg/mL，IC50為0.42μg/mL，LOD為5.82 ng/mL。然后在獲得Cy4單克隆抗體的基礎(chǔ)上進一步詳盡地優(yōu)化了各項反應(yīng)參數(shù)，如包被液種類、包被原工作濃度、單抗工作濃度、封阻物質(zhì)、濃度及時間、標品稀釋液中DMSO濃度、競爭反應(yīng)時間、酶標二抗使用濃度、酶與底物反應(yīng)時間等，最終建立標準曲線，其檢測范圍為0.027 ng/mL～67.67 ng/mL，IC50為1.36 ng/mL，LO