免疫學(xué)檢測(cè)方法

1、檢測(cè)技術(shù)種類(lèi),一、免疫學(xué)檢測(cè) 免疫凝集試驗(yàn) 免疫沉淀試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫試驗(yàn) 熒光免疫技術(shù) 免疫電鏡技術(shù) 免疫印跡試驗(yàn),細(xì)菌凝集反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌學(xué)的診斷。在凝集反應(yīng)中，將參與反應(yīng)的抗原稱(chēng)為凝集原，抗體稱(chēng)為凝集素。凝集法測(cè)定哈維氏弧菌抗體的效價(jià),1.稀釋抗體,2.玻片凝集法,用1ml移液槍取6號(hào)離心管中的溶液一滴滴在載玻片的一端，另一端加一滴磷酸鹽緩沖液，然后分別加一滴準(zhǔn)備好的X菌液。 牙簽混勻，至于顯微鏡下觀察

2、，看是否有凝集塊的形成。 后取5、4……1號(hào)管的溶液逐個(gè)重復(fù)1、2步驟。 取有凝集塊變?yōu)闊o(wú)凝集塊時(shí),那個(gè)有凝集反應(yīng)的試管作為抗體的效價(jià)。,沉淀凝集反應(yīng),雙向免疫擴(kuò)散沉淀線(xiàn)示意圖,瓊擴(kuò)反應(yīng),中和實(shí)驗(yàn),熒光免疫技術(shù),熒光免疫技術(shù)又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)。它將免疫化學(xué)和血清學(xué)的高度特異性和敏感性與顯微技術(shù)的高度精確性相結(jié)合，為免疫學(xué)、臨床組織化學(xué)及實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一項(xiàng)其它方法尚不能取代的、并有其獨(dú)特風(fēng)格的技術(shù)。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、

3、原蟲(chóng)以及真菌等的鑒定和相應(yīng)病的診斷，血清抗體的檢查，病理組織學(xué)抗原、抗體和補(bǔ)體的鑒定及定位，免疫復(fù)合物病理的研究，細(xì)菌、病毒與細(xì)胞之間抗原關(guān)系的研究等方面。其主要優(yōu)點(diǎn)在于：特異性強(qiáng)，速度快，敏感性高；其缺點(diǎn)在于：非特異性染色問(wèn)題尚未解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也比較復(fù)雜。,1、原理,熒光免疫技術(shù)是一種以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù)，熒光物質(zhì)的分子在特定條件下吸收激發(fā)光的能量后，分子呈激發(fā)態(tài)而極不穩(wěn)定，其迅速回到基態(tài)時(shí)，以電磁

4、輻射形式釋放出所有的光能，發(fā)射出波長(zhǎng)較照射光長(zhǎng)的熒光。熒光免疫技術(shù)可分為熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)和熒光測(cè)定技術(shù)。熒光抗體技術(shù)屬于前者，它是利用某些熒光素通過(guò)化學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合，形成的免疫復(fù)合物在一定波長(zhǎng)光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光，因此借助熒光顯微鏡檢測(cè)或定位被檢抗原。其又可分為直接熒光抗體法、間接熒光抗體法和補(bǔ)體熒光抗體法。,熒光色素,異硫氰酸熒光素（FITC）四乙基羅丹明（RB200）四甲基異硫氰酸羅丹明（TMRITC),1、熒光抗體

5、染色方法 直接法 間接法2、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用 在細(xì)菌學(xué)診斷中的應(yīng)用 在病毒感染診斷中的應(yīng)用 其它方面的應(yīng)用,間接熒光抗體法（IFAT）操作步驟如下：（1）單層血細(xì)胞滴片，室溫晾干，放入丙酮中固定10min。室溫晾干。（2）以小白鼠抗血清（或雜交瘤細(xì)胞上清液）為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。37℃濕盒中孵育45min。（3）0.01M PBS洗三次，

6、每次5min。（4）加第二抗體IgG-FITC ，37℃濕盒中孵育45min。（5）0.01M PBS洗三次，每次5min。（6）甘油封片，熒光鏡下觀察，拍照。,間接免疫熒光法檢測(cè)對(duì)蝦白斑癥病毒病,間接免疫熒光法檢測(cè)淋巴囊腫病毒,直接ELISA,間接ELISA,間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作步驟如下：（1）分別以不同單抗為第一抗體，加在血細(xì)胞抗原上。37℃濕盒中孵育60min。（2）0.01M PBS洗三次，每次5min。（3）

7、加AP-IgG 為第二抗體，37℃濕盒中孵育45min。（4）0.01M PBS洗三次，每次5min。（5）加NBT/BCIP底物緩沖液發(fā)色10min，（6）出現(xiàn)顏色加終止液終止反應(yīng)。 （7）用酶標(biāo)分析儀在405nm,處測(cè)定各孔的吸光度，計(jì)算P／N（樣品光吸收值與陰性對(duì)照的值），判定ELISA反應(yīng)結(jié)果。大于2.1時(shí)可判斷為陽(yáng)性。以最大顯色至陽(yáng)性的顯色孔50%反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。,圖 DOT BLOT方法篩選結(jié)果圖。,

8、免疫組織化學(xué)方法定扇貝血細(xì)胞分布,細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)病毒感染,四、Western blot,是蛋白水平檢測(cè)，研究基因表達(dá)與功能的一種方法。 原理及步驟 樣品 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白 （SDS-PAGE )

9、 轉(zhuǎn)移（印跡）于硝酸纖維素膜 加抗體檢測(cè)某種特異性蛋白質(zhì),,,,West Blot,,圖：淋巴囊腫病毒與抗血清的Western blotting結(jié)果,免疫電鏡技術(shù),免疫電鏡技術(shù)（immune electron microscopic technique）是一種將免疫學(xué)技術(shù)與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)方法，能使抗原在分子水平上進(jìn)

10、行定位。它實(shí)際上是將細(xì)胞水平的熒光抗體技術(shù)的基本原理應(yīng)用于分子水平上。這一技術(shù)的發(fā)明使抗原和抗體的定位研究達(dá)到了亞細(xì)胞或分子水平。主要有以下幾種技術(shù)。鐵蛋白抗體法酶標(biāo)記抗體法重金屬標(biāo)記抗體法,圖 膠體金標(biāo)記免疫電鏡結(jié)果[(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm],膠體金免疫技術(shù),膠體金是氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下的水溶液，具有高電子密度，并能與多種大分子發(fā)生物理吸附，因此，不

11、但所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記，而且標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。當(dāng)抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑條（點(diǎn)）,在顯微鏡下觀察，抗原抗體結(jié)合處為黑褐色的顆粒。,斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）的應(yīng)用 與研究進(jìn)展 是20世紀(jì)八十年代發(fā)展起來(lái)的一種免疫學(xué)檢 測(cè)方法，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。目前在 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要應(yīng)用于檢測(cè) HBsAg、HCG 和HIV等。,斑點(diǎn)免疫金滲濾法原理

12、： NCM為固相載體-----通過(guò)滲濾----抗原與抗體在膜上快速反應(yīng)-----標(biāo)記的膠體金堆積顯色。,臨床應(yīng)用： 間接法測(cè)抗體： NCM 抗原----樣品抗體----金標(biāo)抗抗體顯色 夾心法測(cè)抗原： NCM多抗----樣品抗原----金標(biāo)單抗顯色。,直接法檢測(cè)抗原 NCM病毒---金標(biāo)單抗顯色

13、DIGFA步驟簡(jiǎn)化、時(shí)間縮短。,DIGFA檢測(cè)操作程序2µl檢測(cè)樣品-----NCM----直徑2mm點(diǎn)-----晾干； 100µl封閉液，滲入； 100µl的金標(biāo)抗體，滲入；100µl 的0.01M PBS-T（含0.05%Tween-20），滲入；

14、 檢測(cè)結(jié)果：紅色斑點(diǎn)的為陽(yáng)性，無(wú)紅色斑點(diǎn)的為陰性。 陽(yáng)性代表檢測(cè)樣品中有病毒，陰性則無(wú)。,,,,,DIGFA檢測(cè)結(jié)果, 紅色斑點(diǎn)的為病毒陽(yáng)性,無(wú)紅色斑點(diǎn)的為病毒陰性。The result of DIGFA, red dot shows there is WSSV, otherwise, there is no WSSV.,免疫金標(biāo)層析法的應(yīng)用與研究進(jìn)展,免疫金層析法快速診斷試紙

15、條是20世紀(jì)90年代以來(lái)在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù) 醫(yī)學(xué)：乙肝表面抗原、心肌肌鈣蛋白T 、 HCG 獸醫(yī)：豬瘟抗體 食品：克倫特羅（瘦肉精）、氯霉素 其他：飼料中的磺胺類(lèi)藥物殘留物、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品,檢測(cè)試紙的原理是：采用夾心免疫層析原理，即由金標(biāo)單抗同檢測(cè)樣品液中的抗原反應(yīng)，形成由金標(biāo)單抗-抗原復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物層析至硝酸纖

16、維素膜上預(yù)先包被在檢測(cè)線(xiàn)上的另一種單抗處時(shí)，此處的抗體會(huì)識(shí)別該復(fù)合物中抗原，反應(yīng)的結(jié)果便形成了金標(biāo)單抗+抗原+包被單抗的夾心結(jié)構(gòu)，最終是金標(biāo)單抗上的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色線(xiàn)，未反應(yīng)的金標(biāo)單抗則仍繼續(xù)層析前行,當(dāng)?shù)竭_(dá)點(diǎn)預(yù)先包被在質(zhì)控線(xiàn)羊抗鼠抗體處時(shí)，金標(biāo)單抗被其結(jié)合住，從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見(jiàn)的紅色線(xiàn)，結(jié)果是：檢測(cè)線(xiàn)顯示紅色表示樣品陽(yáng)性；檢測(cè)線(xiàn)不顯示紅色，表示樣品陰性。質(zhì)控線(xiàn)顯示紅色，表示

17、試紙有效；質(zhì)控線(xiàn)處不顯示紅色，說(shuō)明試紙失效，即或是金標(biāo)單抗、或是羊抗鼠抗體失活，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。,該試紙條構(gòu)成:載體板7；在該載體板7的兩端部，分別設(shè)有加樣端4吸水層和手持端1吸水層；在該載體板7中部段設(shè)有硝酸纖維膜的檢測(cè)層2，在該檢測(cè)層2與加樣端4吸水層交界處，設(shè)有載有金標(biāo)單抗E的玻璃纖維層塊3，該層塊3一端部分設(shè)置在加樣端4吸水層之下，其另一端部分設(shè)置在檢測(cè)層2之上；在與該層塊3延續(xù)的檢測(cè)層2上設(shè)有檢測(cè)線(xiàn)6和質(zhì)控線(xiàn)5，該檢測(cè)線(xiàn)6和質(zhì)控

18、線(xiàn)5處分別包被有抗病毒單抗和羊抗鼠IgG。,用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。,直接化學(xué)發(fā)光免疫分析,發(fā)光,Y,Y

19、,,Y,,,磁微粒,,被測(cè)抗原,+,抗體,+,,帶丫啶酯標(biāo)記物抗體,,,,,,沖洗后,,,--- 夾心法,（1）加入H2O2（pH<10）,,,,（2）加入堿（pH>10）,,直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理,,,,磁微粒模式圖,,,,,,,Y,,Y,,Y,Y,,Y,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,,特點(diǎn)已結(jié)合的抗原和抗體與未結(jié)合部分的易分離,磁微粒技術(shù),五、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction

20、,PCR）,PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。,Kary B. Mullis,PCR,,ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,TTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAA,Step3 :

21、 Extension 延伸,72°C,CGTAGTAGCA,GCTGCTACGTAG,TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA,原 理：,1) 合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度；2) 反應(yīng)

22、體系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer3) 反應(yīng)程序： 變性 ( 94~95oC) 復(fù)性 延伸 ( 37~55 oC) ( 70~72 oC ) 7

23、2 oC延伸10min 30-35cycles DNA擴(kuò)增100萬(wàn)倍,,,,,PCR擴(kuò)增,,PCR特點(diǎn)及應(yīng)用：,優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定可靠、快速； （2）微量的模板DNA即可擴(kuò)增大量產(chǎn)物。應(yīng)用：（1）基因組DNA分析； （2）遺傳物質(zhì)的鑒定； （3）遺傳病的診斷。缺點(diǎn)：（1）需靶DNA序列的信息；