免疫學應用

1、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳——根據遷移率分離,操作步驟 標記 用鉛筆在薄膜無光澤面(毛面)一端2cm處 輕畫一細線 ，并在右上角做好標記。浸泡 將醋酸纖維素薄膜毛面向下，在緩沖溶液中浸泡，使其充分浸透。點樣 用鑷子將薄膜置于濾紙上，吸收多余的液體(不要太干），利用載玻片 一側蘸取樣品，45度角于毛面細線處點樣。 電泳 將

2、薄膜毛面朝下，置于電泳槽的紗布橋上，點樣端置于負極； 膜條緊貼紗布，待平衡5min后通電，在U=120V電泳40min。 染色 將薄膜取出后，置于氨基黑10B染色劑中，染色5min。漂洗 將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，濾紙吸干。,電泳技術,發(fā)展概念基本原理影響因素種類應用,The Nobel Prize in Chemistry 1948Arne Tiseli

3、us,1808年-----俄國物理學家Re?ss發(fā)現電泳現象。1937年-----瑞典科學家Tiselius首先設計出世界上第一臺自由電泳儀，并建立了“移界電泳”分離模式。以電泳作為一種分離技術，首先證明了血清蛋白是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白組成的。 "for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his

4、discoveries concerning the complex nature of the serum proteins",發(fā)展,20世紀50年代，以支持介質為主的電泳模式不斷涌現，如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。1967年在凝膠電泳的基礎上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術。90年代又推出了分辨率極高的高效毛細管電泳。如今，

5、各類電泳技術已廣泛應用于生命科學各個領域。,基本概念,帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現象稱為電泳(electrophoresis) 。帶電粒子由于帶電性質及電荷量不同，在一定的電場強度下具有不同的移動速度及方向。電泳技術就是根據各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質進行分離的一類實驗技術。,電泳用于分離物質的原理（1）,電荷量及方向：蛋白質為例,等電點,電泳用于分離物質的原理（2）,遷移率：以?來表示，即單

6、位電場強度時粒子運動的速度，取決于帶電粒子的電荷量Q、粒子大小γ和形狀。,電泳用于分離物質的原理（3）,具體實驗中：,V:泳動速度cm/秒or分d:泳動距離cmt:電泳時間 (秒/分)E:電場強度 伏特/cm,u:泳動率or泳動度(cm2/伏·秒or分)U:電壓l:支持場的長度 (有效長度),設：混合物中有A、B兩物質：,物質A在電場中移動的距離為: dA= ?AVt/l 物質B的移動距離為：dB= ?BVt/l

7、 則兩物質移動距離之差為： Δd=(dA-dB)=(?A-?B)Vt/l即：物質A、B能否分離取決于兩者的遷移率,影響電泳速度的因素：內因,1.凈電荷：被分離物帶電荷量與電泳速度成正比 2.質點大小：顆粒直徑愈小愈快，分子大小與電泳 速度成反比 3.質點形狀：球形分子比纖維狀分子泳動快。,影響電泳速度的因素：外因（1）,,溶液的pH值 決定帶電粒子的解離的程度，即該物質帶

8、凈電荷多少的決定因素。對蛋白質等兩性電解質而言，pH值離等電點越遠，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動速度也越快，反之，則越慢。 為了使電泳過程中溶液pH值恒定，必須采用緩沖溶液。一般常用的電泳緩沖液pH范圍在4.5~9.0。,影響電泳速度的因素：外因（2）,溶液的離子強度 維持一定的緩沖容量，需要一定濃度的離子，它主要與其濃度和價數相關。 I=1/2?CiZi2 緩沖液I越大，降低樣品（蛋

9、白質）帶電量，泳動速度變慢，最后破壞膠體，但區(qū)分條帶清晰。 緩沖液I越小，緩沖容量小，pH不穩(wěn)定，樣品易擴散；則泳動速度快，條帶分離差。 一般在0.02-0.2。,影響電泳速度的因素：外因（3）,電場強度 是指電場中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電勢梯度。電場強度對電泳的速度起著重要作用，電場強度高，帶電顆粒泳動速度快，電場強度低，帶電顆粒泳動速度慢。 電壓越高，產熱增加

10、，高壓電泳需備冷卻裝置。 否則？,影響電泳速度的因素：外因（4）,支持介質(1)物理化學性質穩(wěn)定：在電泳過程中不受環(huán)境因素的影響，保持原有的狀態(tài)和性能。(2)化學惰性：在電泳過程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子和待分離的生物大分子發(fā)生化學反應，不干擾生物大分子的電泳過程。(3)分布均勻：內電滲小，結果重復性好。,電滲作用,液體對固體支持物的相對移動，在電場中，由于多孔支持物吸附水中的正或負離子使溶液相對帶電，在電場作用下，溶液帶

11、動樣品向一定方向移動。,種類：,自由界面電泳區(qū)帶電泳：紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、粉末電泳、細絲電泳、凝膠電泳。連續(xù)系統(tǒng)：電荷效應、分子篩效應不連續(xù)系統(tǒng)：濃縮效應、電荷效應、分子篩效應盤狀平板式垂直板式,,,,電荷效應：電荷量不同，遷移率不同。分子篩效應：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率，這就是分子篩效應。分子量小，阻力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。,,

12、電泳技術的應用,分離純化樣品測定分子量組建物理圖譜鑒定重組體分子雜交測序PCR檢測分子標記檢測,醋酸纖維素膜：是一種由醋酸纖維加工制成的一種細密且薄的微孔膜。廣泛應用于醫(yī)學臨床中各種生物分子的分離分析中。（醋酸纖維素薄膜電泳分離血清清蛋白）瓊脂糖凝膠：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。聚丙烯酰胺凝膠：可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。其分辨率較高。（等電聚焦電泳分離血

13、紅蛋白和細胞色素C） 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質。,,電泳介質：,,原理：以醋酸纖維素薄膜為支持物，在PH=8.6的巴比妥緩沖液中，血清蛋白的PI均小于8.6，帶負電荷，電泳時向正極移動。由于遷移率不同而被分離。,醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白,,,,表-1 血清中各蛋白質的相關特性,種 類,分子量(萬）,PI,分 布(%),清蛋白,?1-球蛋白,?2-球蛋白,?-球蛋白,?-球蛋白,6.9,5.0,

14、9.0,13.0,11.0,4.8,5.0,5.0,5.2,6.8-7.5,55,2.1~30.8,4.1~72.5,1.2~25,15.6,蛋白質染料——氨基黑10B 酸性染料，其磺酸基與蛋白質反應構成復合鹽，是最常用的蛋白質染料。這類染料對不同的蛋白質結合量不同，染色不均一和高背景影響蛋白質的定量。染色靈敏度較低，現在這類染料已很少應用，被靈敏度較高的考馬斯亮藍所代替。,優(yōu)缺點,醋酸纖維薄膜廣泛應用于醫(yī)學臨床中各種生物分子的

15、分離分析中，如血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、類固醇及同工酶等。它具有簡單快速、對蛋白質樣品吸附極少，無“拖尾”現象，染色后蛋白質區(qū)帶更清晰等優(yōu)點，電滲作用雖然較高但很均一 ，不影響樣品的分離效果。不足之處是分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，由于薄膜厚度小（約10～100μm），樣品用量很少，不適于制備。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,前清蛋白,清蛋白,?-球蛋白,?-球蛋白,臨床意義：,,白蛋白：

16、主要在肝臟合成，所以與肝臟疾患密切相關。α球蛋白的增加與發(fā)熱有關，與炎癥有關。β球蛋白增加常伴隨血中脂質的增加。γ球蛋白含有抗體成分，在許多慢性感染、免疫性疾病中有異常。例如：多發(fā)性骨髓瘤病人在β球蛋白與γ球蛋白之間出現一個尖峰：M蛋白 肝硬化病人γ球蛋白增加，白蛋白降低。,思考題,預習：實驗五、六,凝膠層析分離蛋白質混合物的原理？何謂分子篩效應？DNS—氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析中，各種氨基酸是怎